Listeria monocytogenes in the ready-to-eat meat-based food chain : characterization and preventive control measures assessment

Autor: Henriques, Ana Rita Barroso Cunha de Sá
Přispěvatelé: Fraqueza, Maria João dos Ramos
Jazyk: angličtina
Rok vydání: 2016
Předmět:
Zdroj: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal
Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)
instacron:RCAAP
Popis: Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias – Especialidade de Segurança Alimentar In some studies, ready-to-eat meat-based food products (RTEMP) are considered the food vehicle with the highest risk of being contaminated with Listeria monocytogenes. One of the aims of this work was to assess L. monocytogenes presence in Portuguese ready-to-eat meat processing industries and retail establishments. Environment and final product samples were analyzed and an audit was performed in ten industrial facilities to determine the level of implementation of good hygiene and manufacturing practices. To identify likely sources of final products contamination, as well as to assess virulence-associated traits, phenotypic and genotypic characterization of L. monocytogenes isolates was performed. Selected isolates were also characterized for their biofilm-forming ability and subsequently tested for their biocide susceptibility using benzalkonium chloride, sodium hypochlorite and nisin. Finally, the genetic relation of L. monocytogenes strains isolated from RTEMP (at industrial and retail level) and from human listeriosis cases was assessed. L. monocytogenes frequency was high in industrial RTEMP and its occurrence was linked to high scored industries in the hygienic audit, being specifically related to inadequate hygiene and manufacturing practices. L. monocytogenes isolates were genetically diverse and serogroups IIa, IIb and IVb were frequent among them. The isolates also displayed a similar profile of major virulence-associated genes profile and a low level of antibiotic resistance. Most of the selected L. monocytogenes strains demonstrated to be moderate and strong biofilm-formers, particularly those from serogroups IIc and IVb. When treated with benzalkonium chloride and sodium hypochlorite, most of the strains in biofilm exhibited a reduction in cell counts, however it was not possible to determine the minimal bactericidal concentration within the tested range for nisin. Three resistant strains to commercially recommended concentrations for benzalkonium chloride and sodium hypochlorite were identified. Some particular RTEMP strains presented high similarity with clinical strains, suggesting their potential for human infection. Overall, the findings in this work provide valuable information on L. monocytogenes in RTEMP and RTEMP-related environments, also highlighting RTEMP as potential vehicles for human listeriosis. RESUMO - Caracterização de Listeria monocytogenes na fileira dos alimentos prontos-a-consumir à base de carne e avaliação das medidas preventivas de controlo - Listeria monocytogenes é uma bactéria patogénica de distribuição ubiquitária. L. monocytogenes encontra-se normalmente em ambientes naturais como na água, solo e vegetação, mas também em géneros alimentícios e alimentos para animais. O género Listeria engloba várias espécies, contudo apenas L. monocytogenes é considerada patogénica para o Homem. Apesar de relativamente rara, a listeriose humana apresenta a mais alta taxa de fatalidade das doenças infecciosas de origem alimentar. O quadro clínico é variável, com sinais inespecíficos que podem evoluir para meningite e encefalite, septicémia, morte fetal e aborto. Nos últimos anos, a incidência de listeriose na Europa tem apresentado uma taxa significativamente crescente. Os grupos de risco da listeriose estão bem identificados e incluem indivíduos com idade superior a 65 anos, imunocomprometidos, mulheres grávidas, fetos e recém-nascidos. A listeriose é quase exclusivamente transmitida pela ingestão de alimentos contaminados por L. monocytogenes, sendo apontados como veículo principal os alimentos prontos-a-consumir. Graças à facilidade e conveniência de consumo, por não requererem um tratamento térmico prévio, os alimentos prontos-a-consumir à base de carne são dos mais procurados a nível global. O facto destes alimentos possuírem uma vida útil refrigerada relativamente longa faz com que sejam frequentemente associados a L. monocytogenes, sendo referidos nalguns estudos como os alimentos com a maior probabilidade de estarem contaminados por esta bactéria. L. monocytogenes possui a capacidade de se desenvolver em refrigeração e de produzir biofilmes, permanecendo viável durante longos períodos em ambientes de processamento alimentar. Os equipamentos de fatiagem, pesagem e embalamento constituem vetores de L. monocytogenes para os alimentos, geralmente através de contaminação cruzada posterior ao tratamento listericida. Um dos objetivos deste trabalho foi avaliar a presença de L. monocytogenes em alimentos prontos-a-consumir à base de carne recolhidos em indústrias produtoras e em estabelecimentos de venda a retalho em Portugal. Para tal, nas unidades industriais procedeu-se à colheita de amostras para análise microbiológica do produto final e das superfícies de equipamentos de contacto directo com alimentos, antes e após a lavagem e desinfeção de rotina. Com o objectivo de relacionar a classificação de auditoria com a ocorrência de L. monocytogenes e analisar as potenciais causas implicadas, efetuaram-se auditorias higio-sanitárias nas unidades industriais. Nestas auditorias, avaliou-se o nível de implementação do sistema de gestão de segurança dos alimentos, com base nos requisitos do Codex Alimentarius e da legislação em vigor nos Estados-Membros europeus. Nos estabelecimentos de venda a retalho, procedeu-se à colheita de amostras pré-embaladas e também de amostras que foram fatiadas nos equipamentos existentes na secção de charcutaria desses retalhistas. A caracterização fenotípica e genotípica dos isolados de L. monocytogenes foi efetuada com o objetivo de identificar características associadas à virulência e de estabelecer possíveis fontes de contaminação para o produto final. Posteriormente, avaliou-se a potencial relação genética dos isolados de L. monocytogenes obtidos a partir de alimentos (de origem industrial e de retalho) com isolados de casos de listeriose humana. Após selecção de isolados de L. monocytogenes representativos dos vários serogrupos e pulsotipos, e também de diferentes tipos de amostras recolhidas na indústria e retalho alimentar, avaliou-se a sua capacidade para formar biofilmes. A suscetibilidade a biocidas dos isolados de L. monocytogenes em biofilme foi também estudada. Para tal, foram selecionados os biocidas mais frequentemente utilizados nas indústrias auditadas para a desinfeção de superfícies de contacto directo com o produto final, nomeadamente, cloreto de benzalcónio e hipoclorito de sódio. A suscetibilidade à nisina, uma bacteriocina produzida por Lactococcus lactis subsp. lactis, com atividade bactericida contra L. monocytogenes e considerada uma alternativa natural a biocidas sintéticos, foi também avaliada. Os biofilmes de L. monocytogenes foram tratados com uma gama de concentrações dos biocidas em estudo durante 5 minutos a 20°C. A frequência de L. monocytogenes em alimentos prontos-a-consumir à base de carne recolhidos na indústria foi elevada (25%). A sua ocorrência foi associada a unidades com elevada classificação na auditoria higio-sanitária, estando particularmente relacionada com práticas inadequadas de higienização e de manipulação de alimentos. Nos alimentos recolhidos na venda a retalho, a frequência de L. monocytogenes foi ligeiramente inferior (10%). Contudo, nalguns alimentos a bactéria encontrava-se acima do limiar de enumeração estabelecido nos critérios microbiológicos europeus de segurança dos alimentos. A subtipagem por eletroforese em campos pulsáteis dos isolados de L. monocytogenes revelou a diversidade genética da população estudada. Os isolados apresentaram um perfil de genes de virulência semelhante e os serogrupos IIa, IIb e IVb foram os mais frequentes. Foi observada uma reduzida frequência de resistência aos antibióticos testados, que incluíram os mais frequentemente utilizados em medicina humana e veterinária. Considerando os resultados obtidos na caracterização genética, a contaminação dos produtos finais não parece estar relacionada exclusivamente com as superfícies de contacto directo analisadas, sugerindo outras possíveis fontes. Os sistemas de gestão da segurança dos alimentos das indústrias avaliadas revelaram necessitar de melhoria e optimização, nomeadamente na conceção e manutenção dos equipamentos, na prevenção da contaminação após o tratamento listericida, na validação dos procedimentos de higiene, na análise de causas de não conformidades microbiológicas e também nas atitudes dos manipuladores de alimentos em prol da higiene. A presença de L. monocytogenes foi relacionada com indústrias com classificação elevada na auditoria higio-sanitária. Apesar da aparente contradição, tal facto parece resultar de uma prévia identificação da bactéria na unidade, sem uma adequada análise de causas, não permitindo que a verdadeira fonte de contaminação por L. monocytogenes fosse identificada, perpetuando a sua presença nessas instalações. Reforça-se, assim, a importância da realização de um diagnóstico conjunto, baseado em evidências de auditoria e avaliação microbiológica, o que proporciona uma visão mais fidedigna do sistema de gestão da segurança dos alimentos implementado. Todos os isolados de L. monocytogenes apresentaram capacidade para formar biofilme, tendo a maioria revelado aptidão moderada e forte, particularmente os isolados pertencentes aos serogrupos IIc e IVb. O método de enumeração de células viáveis não conseguiu refletir a classificação obtida pelo método da quantificação da densidade ótica do cristal de violeta, utilizados para a avaliação da capacidade de formação de biofilmes. Na maioria dos biofilmes de isolados de L. monocytogenes, foi possível medir uma redução nas contagens de células viáveis quando aqueles foram tratados com diferentes concentrações de cloreto de benzalcónio e hipoclorito de sódio. No entanto, o mesmo não foi possível observar quando os biofilmes foram submetidos a diferentes concentrações de nisina. Com os dados obtidos estabeleceram-se curvas de morte bacteriana, estimando-se a LD90. Verificou-se uma associação positiva entre os parâmetros de avaliação da formação de biofilme e os valores estimados de LD90. Três isolados de L. monocytogenes foram considerados resistentes, apresentando valores de LD90 significativamente mais elevados do que os obtidos pelos restantes isolados. Os isolados considerados resistentes necessitariam de concentrações de cloreto de benzalcónio e hipoclorito de sódio bastante superiores às recomendadas comercialmente pelos fabricantes desses desinfetantes. Este ensaio reforça a necessidade de minimização de todos os fatores que permitem a instalação e o desenvolvimento de biofilmes de L. monocytogenes, pois apesar da aplicação de biocidas garantir algum grau de controlo, este não é eficaz em todos os isolados. Por isso, a utilização de novas estratégias de controlo, isoladamente ou de acordo com o preconizado na tecnologia de barreiras, considerando os biofilmes de L. monocytogenes, é fundamental. Por fim, alguns isolados alimentares apresentaram elevada semelhança genética com isolados clínicos, sugerindo o consumo de alimentos prontos-a-consumir à base de carne como potencial factor de risco para a infeção humana. N/A
Databáze: OpenAIRE
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