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Dissertation, Universität Duisburg-Essen, 2016 Parvuline gehören zur Gruppe der Peptidyl-Prolyl-cis/trans-Isomerasen (PPIasen) und katalysieren die Isomerisierung von Peptidyl-Prolyl-Bindungen. Sie spielen sowohl bei der Proteinfaltung als auch bei der Funktionsregulation anderer Proteine eine wichtige Rolle. 2010 wurde das 42 kDa große Parvulin aus dem humanen Pathogen T. brucei als neues Familienmitglied identifiziert. Das Mehrdomänen-Protein verfügt neben der konservierten C-terminalen PPIase-Domäne über eine N-terminale FHA-Domäne. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das TbPar42 strukturell sowie funktionell mit NMR-Spektroskopie charakterisiert. Wegen des hohen Molekulargewichts wurden einzelne Teilkonstrukte von TbPar42 (Domänen und der zwischenliegende Linker) exprimiert und deren 3D-Strukturen in Lösung aufgeklärt. Mit Hilfe von HSQC- und TROSY-Experimenten konnte gezeigt werden, dass die strukturierten Domänen im vollständigen Protein über einen größtenteils unstrukturierten Linker verbunden sind und nicht miteinander wechselwirken. Obwohl die TbPar42-PPIase-Domäne über eine Parvulin-Topologie verfügt und strukturell dem humanen phosphospezifischen Parvulin-Vertreter Pin1 ähnelt, konnte gegenüber potentiellen phosphorylierten Substraten keine Isomeraseaktivität festgestellt werden. Da in Protease-gekoppelten Isomeraseassays auch keine Aktivität gegenüber unphosphorylierten Motiven beobachtet wurde, muss bei der TbPar42-PPIase von einer katalytisch inaktiven Domäne ausgegangen werden. Anders als für einige prokaryotische Parvuline, ließ sich für TbPar42 in einem Rückfaltungs-Assay auch keine Chaperonaktivität nachweisen. Die FHA-Domäne des TbPar42 wurde zusammen mit den 30 Aminosäuren des vorausgehenden N-Terminus exprimiert und strukturell untersucht. Während der N-Terminus flexibel und unstrukturiert ist, ist die FHA-Domäne in Form eines 11-strängigen β-Faltblatt-Sandwiches gefaltet, mit zusätzlichen helikalen Elementen auf der Seite des 5-strängigen Faltblattes. TbPar42-FHA ist in der Lage Phosphothreonin-Peptide zu binden. Wie bei anderen FHA-Domänen bekannt, sind auch bei TbPar42 an dieser Bindung hauptsächlich Loop-Regionen des Proteins beteiligt. Typische FHA-Domänen favorisieren die Bindung von Peptiden mit einer bestimmten Aminosäure an der dritten Position nach dem Phosphothreonin (pTXXD- oder pTXXI/V/L-Motive). Eine solche Präferenz ließ sich für die TbPar42-FHA in NMR-Titrationsstudien mit Heptapetiden nicht belegen. Die TbPar42-FHA hat eine hohe strukturelle Übereinstimmung mit der NIPP1-FHA, die eine Funktion beim mRNA-Spleißing einnimmt. Ob auch TbPar42-FHA oder das vollständige Protein eine Funktion bei der mRNA-Prozessierung hat, muss in weiteren Studien überprüft werden. Parvulins belong to the group of peptidyl prolyl cis/trans isomerases (PPIase) and catalyze the isomerization of peptidyl prolyl bonds. They play an important role both in protein folding and in functional regulation of other proteins. In 2010, the 42 kDa Parvulin from the human pathogen T. brucei has been identified as a new member of this protein family. In addition to the conserved C-terminal PPIase domain the multi-domain protein posesses an N-terminal FHA domain. In this work TbPar42 has been structurally and functionally characterized by NMR spectroscopy. Because of the high molecular weight of the full length protein, single domain constructs of TbPar42, including the intermediate linker, were expressed and their 3D structures were determined in solution. HSQC and TROSY experiments showed that the structured domains of the full length protein are connected via a largely unstructured linker and that the domains do not interact with each other. Although the TbPar42 PPIase domain exhibits a parvulin topology and a high structural similarity to the human phosphospecific parvulin representative Pin1, no isomerase activity for potential phosphorylated substrates was found. Since the PPIase domain didn’t show isomerase activity for unphosphorylated motives in protease coupled isomerase assays either, we conclude that the PPIase domain of TbPar42 is likely catalytically inactive. Furthermore unlike some prokaryotic parvulins, no chaperone activity could be observed in a refolding assay. The FHA domain of TbPar42 was expressed and structurally analyzed together with the 30 amino acids long N-terminus. While the N-terminus is flexible and unstructured, the FHA domain is folded into an 11-stranded β-sandwich, with additional helical elements flanking the 5-stranded β-sheet. TbPar42-FHA is capable of binding phosphothreonine peptides. In the TbPar42 FHA domain mainly loop regions of the protein are involved in peptide recognition, which has been observed for other FHA domains as well. Typical FHA domains favor the binding of peptides with a specific amino acid at the third position after the phosphothreonine (pTXXD- or pTXXI/V/L motives). In NMR titration studies with heptapetides no such preference was observed for the TbPar42 FHA domain. The TbPar42 FHA domain has a high structural similarity to the FHA domain of the NIPP1 protein, which has a function in mRNA splicing. Whether the FHA domain of TbPar42 or the complete protein has a role in mRNA processing as well must be examined in further studies. |
