Nuevas contribuciones de cómo cohesina y PDS5 mantienen la estabilidad genómica durante la replicación del ADN

Autor: Morales Nuñez, Carmen
Přispěvatelé: Losada Valiente, Ana, UAM. Departamento de Bioquímica, Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO), Losada Valiente, Ana (dir.)
Jazyk: angličtina
Rok vydání: 2020
Předmět:
Zdroj: Biblos-e Archivo: Repositorio Institucional de la UAM
Universidad Autónoma de Madrid
Biblos-e Archivo. Repositorio Institucional de la UAM
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Popis: Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Medicina, Departamento de Bioquímica. Fecha de lectura: 24-02-2020
The cohesin complex is a major chromatin organizer that affects most nuclear processes. The dynamic association of cohesin with chromatin is an important determinant for its functions and is controlled by several cohesin-associated factors. PDS5 is one such factor. In vertebrate cells, PDS5 exists in two isoforms, PDS5A and PDS5B, but their functional specificity remains obscure. To shed light into this question, we sought to identify specific interactors for each PDS5 protein by proteomic analysis of immunoprecipitates obtained from human cell extracts using PDS5A and PDS5B specific antibodies. We failed in our endeavour but instead found that both PDS5 isoforms interact with proteins involved in the fork protection pathway. We thus decided to expand on previous work in our group showing that impaired cohesin dynamics in PDS5 deficient mouse embryo fibroblasts interfered with DNA replication. We generated human cell lines deficient for each or both PDS5 proteins and first confirmed using DNA fiber assays that stabilization of cohesin on chromatin by depletion of the two PDS5 proteins, or the cohesin releasing factor WAPL, prevents replication fork advancement, which is restored if cohesin is co-depleted. We further showed that PDS5 and cohesin are required for fork protection by stabilizing BRCA2, RAD51 and WRNIP1 at stalled forks, which in turn prevent uncontrolled MRE11-mediated single stranded DNA resection. The two PDS5 proteins, PDS5A and PDS5B, play redundant roles in cohesin release and also in the recruitment or stabilization of fork protection proteins so defects were only observed in the absence of both. Under that condition, proliferation was severely impaired and increased DNA damage and cell death was observed. Overall our results provide new insights into the role of cohesin and PDS5 in DNA replication and replication fork protection that takes place after replication stress.
El complejo de cohesina juega un papel esencial en la organización cromosómica y afecta así a la mayor parte de los procesos nucleares. La asociación de la cohesina con la cromatina es dinámica, una característica que regula sus funciones y que viene determinada por la acción de varias proteínas que se asocian al complejo. PDS5 es una de ellas. En células de vertebrados, existen dos isoformas de PDS5, PDS5A y PDS5B, cuyas funciones específicas aún se desconocen. Para aclarar esta cuestión, hemos tratado de identificar proteínas que interaccionaran de forma exclusiva con PDS5A y PDS5B analizando los immunoprecipitados obtenidos de extractos de células humanas con anticuerpos que reconocen una u otra isoforma mediante espectrometría de masas. Si bien nuestra aproximación experimental no ha tenido éxito, en el camino hemos encontrado que ambas isoformas de PDS5 interaccionan con proteínas que participan en la protección de horquillas de replicación. Por ello, decidimos profundizar en resultados previos de nuestro grupo que apuntaban a la importancia de la asociación dinámica de la cohesina con cromatina en el proceso de replicación del ADN. Con este fin se generaron líneas celulares humanas deficientes para una o ambas proteínas PDS5. Mediante ensayos de molécula única en fibras de ADN confirmamos que la eliminación de las proteínas PDS5, o de otro factor denominado WAPL que también descarga la cohesina de la cromatina, impide el avance eficiente de la horquilla de replicación. Estos defectos se rescatan al eliminar la cohesina. También demostramos que PDS5 y cohesina son necesarias para proteger la integridad de las horquillas de replicación que están paradas, pues facilitan el reclutamiento a dichas horquillas de BRCA2, RAD51 y WRNIP1. Estas proteínas, a su vez,impiden la acción de la nucleasa MRE11. Tanto PDS5A como PDS5B, pueden descargar la cohesina de cromatina y reclutar a las proteínas que participan en la protección de las horquillas replicativas, de modo que sólo se observan defectos en estos procesos en ausencia de ambas isoformas. En esta condición, las células apenas proliferan y se observa acumulación de daño en el ADN y mayor muerte celular. En conjunto, nuestros resultados ponen de manifiesto la importancia de cohesina y las proteínas PDS5 en la replicación del ADN y en la protección de las horquillas de replicación que tiene lugar en respuesta al estrés replicativo.
This Thesis has been supported by an FPI “Severo Ochoa” fellowship awarded to Carmen Morales (SVP-2014-068612) and research grants from MINECO and FEDER Funds BFU2013-4841-R and BFU2016-79841-R.
Databáze: OpenAIRE
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