| Popis: |
Oksidacijski stres je neravnoteža između nastajanja slobodnih kisikovih radikala i njihove neutralizacije u organizmu te se povezuje s patogenezom brojnih bolesti. U epidemiološkim studijama kao pokazatelj stupnja oksidacijskog stresa koristi se malondialdehid (MDA), produkt lipidne peroksidacije. Mjerenje koncentracije MDA u plazmi ukazuje na oksidacijski stres cijelog organizma, a pretpostavlja se da je koncentracija MDA u urinu također mjera oksidacijskog stresa cijelog organizma. Kako je urin lakše sakupiti od krvi svrha je ovog istraživanja bila razviti pouzdanu i primjenjivu metodu za mjerenje MDA u urinu, a koja bi se mogla koristiti u epidemiološkim studijama. Metoda koja se najčešće koristi za određivanje koncentracije MDA u biološkom uzorku je metoda s 2-tiobarbituratnom kiselinom (TBA) u kojoj MDA reagira s dva ekvivalenta TBA i nastaje MDA-(TBA)2. Reakcija se odvija u kiselim uvjetima i na visokoj temperaturi pri čemu nastaje crveni pigment MDA- (TBA)2. U literaturi se navodi da ta metoda nije specifična jer i druge komponente uzorka (ugljikohidrati, neke aminokiseline i pigmenti žuči) reagiraju s TBA. Također, smatra se da uvjeti reakcije MDA s TBA (niski pH i visoka temperatura) dovode do dodatnog nastajanja MDA, odnosno do tzv. „lažno pozitivnih rezultata“. Stoga je prvi cilj našeg istraživanja bio pronaći uvjete pH i temperature prilikom reakcije MDA s TBA, koji ne bi dovodili do lažnih rezultata, a još uvijek reakcija bila potpuna. Ispitivali smo različite temperature (80° i 90 °C) i različite dužine zagrijavanja (10, 20, 30, 40, 60 i 90 minuta) te različite pH reakcijske smjese. Pored toga ispitivali smo i moguće komponente urina (urea i kreatinin) koje bi mogle dovoditi do lažno pozitivnih rezultata. Naša ispitivanja proveli smo na spektrofotometru Agilent 8453 UV-Vis (Agilent Technologies, CA, USA) kod valne duljine λ=532 nm. Ispitivanja su pokazala da je najoptimalnije pripremanje uzoraka takvo da se u 800 μl uzorka urina doda 500 μl TBA (0.6%) i 1, 5 ml fosforne kiseline (1%) pri čemu je pH reakcijske smjese oko 2. Uzorci se potom promiješaju i zagriju u termostatu 30 minuta na 90 oC. Ispitivanje provedeno s ureom i kreatininom pokazalo je da one u tim uvjetima ne interferiraju u mjernom području našeg analita. Za validaciju metode korišteni su standardi dobiveni razrjeđivanjem komercijalnog standarda MDA (1, 1, 3, 3 tetraeoksipropan) koncentracija 0, 76 ; 2, 02 ; 6, 07 ; 10, 11 i 20, 23 μM. Baždarni pravac bio je linearan s faktorom korelacije (r2) 0, 9993. Ponovljivost u seriji izražena kao koeficijent varijacije (CV) bila je 1, 38 %, a CV ponovljivosti iz dana u dan 4, 11 %. Limit detekcije bio je 0, 12 μM. Mjerenjem koncentracije MDA u 10 uzoraka urina ljudi dobivene su vrijednosti u rasponu od 1, 66 do 5, 92 μM. To pokazuje da je razvijena metoda primjenjiva za mjerenje MDA u urinu te se može koristiti za epidemiološke studije praćenja razine oksidacijskog stresa u urinu. |
