| Popis: |
U proizvodnji bioetanola kvasac Dekkera bruxellensis vrlo je zanimljiva alternativa kvascu Saccharomyces cerevisiae. Obje vrste brzo fermentiraju šećere i proizvode visoke koncentracije etanola, ali kvasac D. bruxellensis fermentira i disaharid celobiozu te kao izvor dušika koristi i nitrat. Međutim, biotehnološki potencijal ove vrste danas je neiskorišten jer do sada nije bilo moguće ciljano mijenjati njegov genom, tj. metodama genetičkog inženjerstva nije bilo moguće konstruirati sojeve željenih karakteristika. Stoga je cilj ovog rada bio razviti metodologiju za preciznu modifikaciju genoma ovog kvasca, sličnu onoj koja se svakodnevno provodi u modelnom kvascu S. cerevisiae. Razvijena je metoda genetičke transformacije, temeljena na elektroporaciji, kojom se u stanice kvasca D. bruxellensis unosi transformirajuća DNA. Nadalje, konstruirani su integrativni i replikativni plazmidi koji omogućavaju ekspresiju gena iz drugih organizama u ovom kvascu. U ovoj vrsti uspješnost uvođenja preciznih modifikacija u genom relativno je niska (5 – 10%) te ovisi o duljini homologne DNA na krajevima transformirajućeg fragmenta i mehanizmu njegove ugradnje. Međutim, ekspresija gena RAD54 iz kvasca S. cerevisiae, gena koji sudjeluje u procesu homologne genetičke rekombinacije, podigla je uspješnost genskog ciljanja u kvascu D. bruxellensis za oko 3 puta. S druge strane, ekspresija gena RAD52 iz kvasca S. cerevisiae, također uključenog u proces homologne rekombinacije, smanjila je već prethodno nisku uspješnost preciznih modifikacija genoma. Zahvaljujući razvijenoj metodologiji, u ovom radu konstruiran je i soj kvasca D. bruxellensis koji eksprimira transporter ksiloze, ksiloza reduktazu, ksilitol dehidrogenazu i ksilulokinazu pa stoga može rasti na podlozi na kojoj je ksiloza jedini izvor ugljika. Ovaj soj biotehnološki je značajan jer se u proizvodnji bioetanola druge generacije kao supstrat koriste lignocelulozni hidrolizati bogati ovim teško iskoristivim šećerom. |
