| Popis: |
Proteini SSB (engl. Single-Stranded DNA-Binding proteins) esencijalni su u replikaciji, popravku i rekombinaciji DNA u svim organizmima. Nespecifičnim i kooperativnim vezanjem jednolančane DNA proteini SSB sprječavavaju stvaranje sekundarnih struktura koje narušavaju procese DNA metabolizma, a ujedno i štite jednolančanu DNA od nukleolitičke razgradnje. Istraživanja na proteinima SSB iz streptomiceta provode se već dugi niz godina u Laboratoriju za molekularnu genetiku Instituta Ruđer Bošković u Zagrebu. Za potrebe dosadašnjeg istraživanja koristili su se rekombinantni proteini SSB koji su na N-kraju imali dodane aminokiselinske slijedove ("His-tag" i "TAP-tag") za lakše pročišćavanje na afinitetnim kromatografskim kolonama. Cilj ovog rada bio je klonirati "His-tag-om" neobilježeni gen ssb-l iz bakterije S. coelicolor u ekspresijski vektor pET-15b, te biosintetizirati željeni protein u heterolognom domaćinu, bakteriji E. coli. Rezultati ovog rada omogućit će ispitivanje utjecaja "His-tag-a" na učinkovitost vezanja proteina SSB-L za jednolančanu DNA. Gen ssb-l umnožen je metodom lančane reakcije polimerazom, kloniran pomoću restrikcijskih endonukleaza NcoI i BamHI u plazmid pET-15b te mu je određen slijed nukleotida. Indukcija gena provedena je u ekspresijskim sojevima bakterije E. coli. Biosinteza proteina SSB-L provjerena je elektroforezom ukupnog staničnog lizata u denaturirajućim uvjetima (SDS-PAGE) te Western analizom. |
