| Popis: |
S-adenozilhomocistein-hidrolaza (SAHH) katalizira reakciju hidrolize S-adenozilhomocisteina (SAH) na adenozin i homocistein. Budući da je SAH produkt svih reakcija transmetilacije ovisnih o adenozilmetioninu i njihov kompetitivni inhibitor, njegovo uklanjanje ključno je za održavanje normalnog metilacijskog potencijala stanice te za normalnu funkciju organizma. [1] Do sada je pronađeno nekoliko mutacija koje uzrokuju smanjenje aktivnosti SAHH (R49C, R49H, G71S, D86G, A89V, Y143C, Y328D i W112Ter). U nedavnom istraživanju, uz ove poznate mutacije, kod češkog pacijenta otkrivena je delecija 4pb u kodirajućoj regiji SAHH, koja dovodi do pomaka okvira čitanja i preuranjene terminacije translacije na poziciji aminokiseline 403 (c.1207-1211del, p.N403Ter ; neobjavljeni rezultati). Preliminarna istraživanja pokazuju oko 20% aktivnosti SAHH u eritrocitima te varijabilno povećanje omjera SAH/SAM (S- adenozilmetionina) kod braće, majke i majčinog oca. Općenito, nedostatna aktivnost SAHH dovodi do inhibicije reakcija transmetilacije ovisnih o adenozilmetioninu što uzrokuje teške metaboličke poremećaje te patološka stanja kod ljudi. Ova metabolička bolest prvi put je opisana u Hrvatskoj 2004. godine [2]. U ovom istraživanju SAHH s novootkrivenom mutacijom prekomjerno je eksprimirana u bakterijskom soju E.coli BL21, u trajanju od 4h na 30°C, te je potom izolirana i pročišćena afinitetnom kromatografijom Ni-NTA. Za potvrdu izolacije prekomjerno eksprimiranog proteina i dobivanje uvida u njegovu strukturu korištene su SDS i nativna poliakrilamidna gel elektroforeza. Enzimska aktivnost mutiranog proteina izmjerena je spektrometrijski, uz dodatak 3-(4, 5- dimetiltiazol-2-il)-2, 5-difeniltetrazolijevog bromida (MTT), na temelju promjene apsorbancije uslijed nastajanja formazana u reakciji. Iz dobivenih podataka, kinetički parametri izračunati su korištenjem jednadžbe Michaelis-Menten, pomoću linearizacije Lineweaver-Burk. Također, izmjerena je enzimska aktivnost novootkrivenog mutiranog proteina uz dodatak 5, 5'-ditio-bis-(2-nitrobenzojeve kiseline) (DTNB), reagensa koji reagira s tiolnim skupinama i ditiotreitola (DTT). Kod novootkirvenog mutiranog proteina, kao i kod divljeg tipa i nekih od do sada poznatih mutiranih varijanti primijećen je povrat aktivnosti enzima nakon dodatka DTT-a. |
