| Popis: |
Izoleucil-tRNA-sintetaza (IleRS) je enzim koji katalizira aktivaciju i prijenos izoleucina na tRNAIle (slika 1a, zeleno). Pri tome nastaje Ile- tRNAIle koja je supstrat ribosomske sinteze proteina. Ukoliko je pogreška u sintezi Ile- tRNAIle veća od 1 u 103 ona može biti letalna za stanicu. Prepoznavanje isključivo pripadne tRNAIle ne predstavlja problem jer tRNA ostvaruje niz interakcija s IleRS, dok su aminokiseline znatno manje molekule, a u stanici ima onih koje strukturno i/ili kemijski nalikuju izoleucinu. Zbog toga IleRS može pogriješiti u izboru aminokiseline u sintetskim reakcijama. Kako se pogreška ne bi prenijela u sintezu proteina, IleRS koristi mehanizme popravka pogreške od kojih je najvažniji popravak pogreške poslije prijenosa aminokiseline na tRNA (slika 1a, crveno) koji se odvija u zasebnoj domeni. Cilj ovog istraživanja bio je razumjeti mehanizme kojima IleRS ostvaruje specifičnost prema aminokiselinskim supstratima u sintetskom mjestu i mjestu za popravak pogreške. U tu svrhu kinetički smo okarakterizirali IleRS koristeći niz aminokiselina (slika 1b). Za razliku od prethodno testiranih valina i norvalina koji dobro oponašaju pripadni izoleucin i bivaju diskriminirani s faktorima od 1 u 200, ostale aminokiseline efikasno su diskriminirane s faktorima od 500 do 106 . Unatoč tome, priredili smo tRNA misacilirane svim testiranim aminokiselinama i zasebno testirali njihove hidrolize. Iznenađujuće, IleRS brzo hidrolizira sve misacilirane tRNA (35-85 s-1 ). Dakle, možemo zaključiti kako ni efikasnost diskriminacije aminokiseline u sintetskom aktivnom mjestu, ni prijetnja koju su one mogle predstavljati tijekom evolucije ne uvjetuju brzinu hidrolize navedenih misaciliranih tRNA u mjestu za popravak pogreške. Jedina iznimka jest pripadna Ile-tRNAIle koja se sporo hidrolizira (0, 058 s- 1 ) pa u ukupnoj reakciji aminoaciliranja Ile-tRNAIle uspješno disocira s enzima prije nego što podlegne hidrolizi. To sugerira kako je razvoj specifičnosti mjesta za popravak pogreške uvjetovan upravo očuvanjem IletRNAIle . |
