| Popis: |
Oluessa ja panimoissa elämään sopeutuneita pilaajabakteereita ovat mm. eräät Lactobacillus ja Pediococcus -sukujen maitohappobakteerit, anaerobiset Pectinatus ja Megasphaera -sukujen bakteerit, sekä harvinaisemmat Obesumbacterium proteus ja Zymomonas mobilis. Maitohappobakteerit ovat yleisimpiä olutta pilaavia bakteereita. Lisäksi erilaiset hiivat voivat pilata olutta. Pilaajamikrobit aiheuttavat oluen samentumista ja erilaisia haju- ja makuvirheitä. Mikrobit osoitetaan panimoissa viljelyyn perustuvilla menetelmillä, jotka ovat usein melko hitaita (3-7 vrk). PCR:ään perustuvat menetelmät ovat nopeita ja herkkiä, ja niitä on sovellettu myös panimoiden laadunvalvontaan. Perinteisen PCR:n, jossa osoitetaan DNA:ta, huonona puolena on se, että menetelmän avulla ei kyetä erottamaan eläviä ja kuolleita pilaajabakteereita toisistaan, koska DNA säilyy kuolleissa soluissa stabiilina pitkiä aikoja. RNA on DNA:ta epästabiilimpi molekyyli, joka hajoaa yleensä kuolleesta solusta DNA:ta nopeammin. Käänteiskopiointi-PCR (RT-PCR) on herkkä, spesifinen ja nopea menetelmä RNA molekyylien monistamiseen. RT-PCR:n avulla vain elävien pilaajabakteerien osoittaminen näytteestä voi olla mahdollista. Elävät pilaajamikrobit, jotka pystyvät lisääntymään panimoissa ja/tai valmiissa oluessa, aiheuttavat suurimman hygieniariskin panimoteollisuudelle. Tässä työssä tutkittiin reaaliaikaisen RT-PCR:n soveltuvuutta elävien Lactobacillus brevis, Lactobacillus lindneri ja Pediococcus damnosus -bakteerien osoittamiseen. Lisäksi verrattiin erilaisia RNA-eristysmenetelmiä. RT-PCR:n kohdegeeneiksi valittiin geenit, joiden määrä solussa on riittävän suuri ja ekspressio elävässä solussa konstitutiivistä. Työssä käytetyt kohdegeenit olivat 16S rRNA ja transkription elongaatiofaktorin (Ef-TU) mRNA. RT-PCR suoritettiin yksivaiheisena reaaliaikaisella kvantitatiivisella PCR-menetelmällä (LightCyclerTM, Roche). Työssä vertailtiin myös erilaisten tappokäsittelyjen (kuumennus, desinfiointiaine) vaikutusta kohde-RNA:n hajoamiseen kuolleesta solusta. Eri menetelmillä tapettuja soluja inkuboitiin huoneenlämpötilassa kolmen viikon ajan, jonka aikana kohde-RNA:n hajoamista seurattiin RT-PCR -menetelmän avulla. Vaikka RNA:n määrän todettiinkin hitaasti vähenevän inkubointiajan funktiona sekä kuumentamalla että desinfiointiaineella tapetuista soluista, RNA kohdemolekyylit (16S rRNA ja Ef-TU mRNA) monistuivat RT-PCR:ssä vielä kolme viikkoa tappokäsittelyjen jälkeen. Näin oluen menetelmän ei todettu soveltuvan sellaisenaan elävien oluenpilaajabakteerien osoittamiseen. |
