Μελέτη της γονιδιακής μεταφοράς επισωματικών φορέων σε αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα

Autor: Λάζαρης, Βασίλειος
Rok vydání: 2010
Předmět:
Druh dokumentu: Diplomová práce
Popis: Στη γονιδιακή θεραπεία, οι κλινικές μελέτες μέχρι τώρα χρησιμοποιούν ιϊκούς φορείς για την μεταφορά του διαγονιδίου στα κύτταρα στόχους. Το DNA των ιϊκών φορέων ενσωματώνεται στο γενετικό υλικό των κυττάρων, και αυτό εμπεριέχει τον μεγάλο κίνδυνο της παρεμβολής στο ενδογενές πρόγραμμα γονιδιακής έκφρασης (μεταλλαξιγένεση λόγω ένθεσης). Μια λύση σε αυτή την ανεπιθύμητη κατάσταση είναι η χρήση επισωματικών φορέων και ιδιαίτερα όσων φέρουν χρωμοσωμικά στοιχεία. Παλαιότερα είχε αναφερθεί ότι ο πρότυπος επισωματικός φορέας pEPI που βασίζεται στο Scaffold /Matrix Attachment Region (S/MAR), παραμένει ως σταθερό επίσωμα για πολλές γενεές σε κυτταρικές σειρές ανθρώπου και ποντικού, αλλά δεν παραμένει για πολλές γενεές σε ανθρώπινα CD34+ κύτταρα. Για να ενισχυθεί η ικανότητα του φορέα να υποστηρίξει την γονιδιακή μεταφορά και συγκράτηση του σε πρωτογενή αρχέγονα/προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα, πρώτον ενισχύθηκε η μεταγραφή του S/MAR χρησιμοποιώντας τους ισχυρούς υποκινητές EF1/HTLV ή SFFV για το διαγονιδίο της eGFP και δεύτερον προστέθηκε μια αλληλουχία έναρξης της αντιγραφής (IR) από το γενετικό τόπο των β σφαιρινικών γονιδίων. Στην εργασία αυτή έγινε μεταφορά των νέων αυτών φορέων με την μέθοδο της πυρινικής ηλεκτροδιάτρησης σε κύτταρα CD34+ που απομονώθηκαν από κινητοποιημένο περιφερικό αίμα δοτών μυελού των οστών τα οποία διαμόλυναν επιτυχώς. Στην συνέχεια τα διαμολυσμένα κύτταρα CD34+ επιλέχθηκαν με FACS και καλλιεργήθηκαν σε θρεπτικό υλικό μεθυλοκυτταρίνης. Μετά την πάροδο 14 ημερών, ανιχνεύτηκε, με μικροσκοπία φθορισμού, έκφραση της eGFP στις τελικά διαφοροποιημένες αιμοποιητικές αποικίες που προέκυψαν.
Gene therapy clinical trials are currently based on integrating viral vectors; this approach presents the major risk of insertional mutagenesis. A solution to this side effect could be the use of episomal vectors and particularly the ones carrying chromosomal elements.We previously reported that the prototype episomal vector pEPI, based on a Scaffold /Matrix Attachment Region (S/MAR), functions as a stable episome for many generations in human and murine hematopoietic cell lines, but mediates very low long term retention in human CD34+ cells. To enhance the vector’s potential for gene transfer into primary hematopoietic stem/progenitor cells, (a) was enforced transcription through the S/MAR by using the strong hybrid EF1/HTLV or SFFV promoters to drive expression of the upstream transgene (eGFP) and (b) was included the replication initiation region (IR) from the β-globin gene locus. In this thesis the new vectors where delivered by nucleofection in CD34+ cells isolated from mobilized peripheral blood of healthy donors; th cells were efficiently transfected. Moreover the the transfected CD34+ cells were separated with FACS and cultured in methylocyttarine containing medium. After 14 days, eGFP expression was readily detected by fluorescence microscopy in the differentiated hematopoietic colonies.
Databáze: Networked Digital Library of Theses & Dissertations
Externí odkaz: