Purificazione di plasminogeno con membrane di affinita'
| Autor: | Castro, Claudia <1976> |
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| Jazyk: | italština |
| Rok vydání: | 2014 |
| Předmět: | |
| Druh dokumentu: | Doctoral Thesis |
| Popis: | Alcune patologie dell’occhio come la retinopatia diabetica, il pucker maculare, il distacco della retina possono essere curate con un intervento di vitrectomia. I rischi associati all’intervento potrebbero essere superati ricorrendo alla vitrectomia enzimatica con plasmina in associazione o in sostituzione della vitrectomia convenzionale. Inoltre, l’uso di plasmina autologa eviterebbe problemi di rigetto. La plasmina si ottiene attivando il plasminogeno con enzimi quali l’attivatore tissutale (tPA) e l’urochinasi ( uPA ). La purificazione del plasminogeno dal sangue avviene normalmente attraverso cromatografia di affinità con resina. Tuttavia, le membrane di affinità costituiscono un supporto ideale per questa applicazione poiché possono essere facilmente impaccate prima dell’intervento, permettendo la realizzazione di un dispositivo monouso che fornisce un processo rapido ed economico. Obiettivo di questo lavoro è la preparazione di membrane di affinità per la purificazione del plasminogeno utilizzando L-lisina come ligando di affinità. Per questo scopo sono state usate membrane in cellulosa rigenerata ad attivazione epossidica, modificate con due diversi protocolli per l’immobilizzazione di L-lisina. La densità ligando è stata misurata mediante un saggio colorimetrico che usa l’acido arancio 7 come indicatore. La resa di immobilizzazione è stata studiata in funzione del tempo di reazione e della concentrazione di L-lisina. Le membrane ottimizzate sono state caratterizzate con esperimenti dinamici usando siero bovino e umano, i risultati sono stati confrontati con quelli ottenuti in esperimenti paralleli condotti con una resina commerciale di affinità con L-lisina. Durante gli esperimenti con siero, le frazioni provenienti da ogni fase cromatografica sono state raccolte e analizzate con HPLC ed elettroforesi SDS-PAGE. In particolare, l’elettroforesi dei campioni eluiti presenta una banda del plasminogeno ben definita indicando che le membrane di affinità con L-lisina sono adatte alla purificazione del plasminogeno. Inoltre, è emerso che le membrane hanno maggiore produttività della resina commerciale di riferimento. Some eye conditions like diabetic rethinopaty, macular pukers, retinal detachment may benefit from vitreoctomy. Enzymatic vitreoctomy with plasmin is envisaged to augment or even replace conventional vitreoctomy by proposed means of less surgical risks. In addition, the use of autologous plasmin is beneficial since it avoids rejection problems. Plasmin can be obtained by conversion of plasminogen using a variety of enzymes, including tissue plasminogen activator (tPA) and urokinase plasminogen activator (uPA). The purification of plasminogen from blood is normally performed with bead-based affinity chromatography. However, for ophthalmology applications affinity membranes are ideally suited for the development of a disposable device to be used directly by the surgeon in the operating theatre, since they can be easily packed in small units providing a fast and economic process. Objective of this work was the preparation of affinity membranes for plasminogen purification using L-lysine as affinity ligand. To this aim epoxy activated regenerated cellulose membranes were used as a support for L-lysine immobilization. Two different binding protocols were tested and ligand density was measured using a colorimetric assay with Orange 7 as indicator. L-lysine immobilization yield has been studied as a function of reaction time and L-lysine concentration. The optimized membranes have been characterized in dynamic experiments using bovine and human serum; the results have been compared with the ones obtained in parallel experiments performed with a commercial L-lysine affinity resin used as a benchmark. During chromatographic experiments with serum, fractions have been collected and analyzed with both HPLC and SDS-PAGE electrophoresis. In particular, from SDS-PAGE gel electrophoresis a well-defined plasminogen band can be shown in the eluted samples indicating that the L-lysine affinity membranes are suitable for the purification of plasminogen. Furthermore, the membranes gave higher productivity than the commercial benchmark. |
| Databáze: | Networked Digital Library of Theses & Dissertations |
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