Produção de anticorpos IgY específicos para o vírus da hepatite A purificados de gema de ovo de frangas imunizadas e sua possível aplicação em diagnóstico do vírus no fígado

Autor: Vasconcelos, Gentil Arthur Lins Bentes Mendonça de
Jazyk: portugalština
Rok vydání: 2010
Předmět:
Zdroj: Repositório Institucional da FIOCRUZFundação Oswaldo CruzFIOCRUZ.
Druh dokumentu: masterThesis
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Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
O interesse da literatura científica pela imunoglobulina Y (IgY) é crescente devido a várias vantagens tais como: fácil obtenção, baixo custo, produção em larga escala e método mais adequado quanto ao aspecto bioético. A IgY esta presente em aves e répteis, sendo transferida do soro para a gema dos ovos desses animais através de processo secretório. A produção de imunoglobulina IgY específica contra o vírus da hepatite A se justifica na detecção do vírus da Hepatite A (HAV) em tecido hepático em casos de hepatite fulminante sem diagnóstico definido, em ensaios experimentais para preparação de novas vacinas para hepatite A e a possibilidade de emprego como imunoterapia na prevenção da hepatite aguda pós-exposição ao vírus. Cabe ressaltar que anticorpos anti-HAV atualmente comercializados têm baixa afinidade e têm custo elevado. Nosso estudo consistiu em produzir anticorpos específicos anti-HAV em frangas ISA Brown imunizadas e avaliar seu uso no diagnóstico da hepatite A em tecido. METODOLOGIA: Vinte galinhas divididas em cinco grupos (I-V) foram imunizadas com os seguintes inóculos: Grupo I – Vacina comercial contra hepatite A e Oligodesoxinucleotídeos contendo C-fosfato- guanosina (CpG-ODN); Grupo II – Vacina comercial contra hepatite A; Grupo III – Vírus da Hepatite A, adjuvante incompleto de Freund (IFA) e CpG-ODN; Grupo IV – Vírus da Hepatite A e IFA; Grupo V – IFA (controle). Os ovos foram coletados e purificados pelo método de precipitação em polietileno glicol (PEG). A IgY foi caracterizada e quantificada pelos métodos de ELISA, neutralização in vitro, eletroforese e “Western Blotting”. A detecção do HAV em fígado foi realizada pelo método de imunofluorescência indireta (IIF) com a IgY anti-HAV sendo utilizada como anticorpo primário e IgG de cabra anti-IgY marcada com Alexa Fluor® 488 como anticorpo secundário. Para isto utilizamos amostras de fígado de primatas não-humanos (macacos cynomolgus) infectados e não infectados com HAV, uma amostra humana com hepatite fulminante de etiologia viral por hepatite A e uma amostra humana com hepatite fulminante de etiologia não viral (controle). Os anticorpos primários (IgY) utilizados foram purificados dos ovos dos grupos I e III, e o anticorpo do Grupo V foi utilizado como controle. RESULTADOS E DISCUSSÃO: Todas as aves imunizadas com antígeno HAV soro-converteram, e os anticorpos IgY anti-HAV foram efetivamente transferidos para a gema dos ovos tendo a associação dos adjuvantes IFA mais CPG-ODN se mostrado mais efetiva. Os métodos de caracterização da IgY demonstraram especificidade ao antígeno HAV, contudo o diagnóstico tecidual pela técnica da IIF apresentou excessiva marcação inespecífica, necessitando de aprimoramento na técnica de purificação da imunoglobulina para uso nesta finalidade.
Immunoglobulin Y (IgY) is found in birds and reptiles, currently used by the advantage of being transported from serum to the yolk of eggs of these animals. This protein is purified from egg yolk of immunized birds with a specific antigen, and the IgY easily accessible and has bioethical character, because the animals do not suffer any injury. Besides low cost, the amount of immunoglobulin produced by animals is very high, accounting for five to ten times the average annual production of IgG in rabbits. Moreover, the conserved mammalian proteins are often more immunogenic in birds than in mammals. Detection of Hepatitis A Virus (HAV) in liver tissue is important in cases of acute liver failure to precisely diagnose the cause of liver failure, in clinical trials to test a new vaccine for hepatitis A, and the possibility of employment as immunotherapy in the prevention of acute hepatitis after exposure to the virus. The anti-HAV antibodies currently marketed have low affinity and have high cost. Our study aims to produce specific anti-HAV in laying hens immunized for detection of HAV in liver. METHODS: Twenty chickens divided into five groups (I-V) were immunized with the following schedule: Group I - commercial vaccine against hepatitis A and C-phosphate-guanosine-oligodeoxynucleotide (CpG-ODN); Group II - commercial vaccine against hepatitis A; Group III - HAV, Freund's incomplete adjuvant (IFA) and CpG-ODN; Group IV - HAV and IFA; Group V - IFA (control). The eggs were collected and purified by the method of precipitation in polyethylene glycol (PEG). The IgY was characterized and quantified by ELISA, neutralization, electrophoresis and Western blotting. The detection of HAV in liver were analyzed by indirect immunofluorescence (IIF) with IgY anti-HAV was used as primary antibody and goat IgG anti-IgY labeled with Alexa Fluor® 488 as secondary antibody. We used samples of liver non-human primates (cynomolgus monkeys) infected and not infected with HAV, a human sample with fulminant hepatitis of viral hepatitis A and a human sample with fulminant hepatitis without viral etiology (control). The primary antibodies (IgY) used were purified from eggs of groups I and III, and the antibody of the Group V was used as control. RESULTS AND DISCUSSION: All immunized chickens were seroconvert, except the birds in the control group, and the protein purified from egg yolk IgY was the anti-HAV. All tissue sections showed staining with IgY anti-HAV independent of the liver is infected or not, while control IgY did not show labeling. In all immunofluorescence was background. The IgY group I had better results than group III, having less unspecific binding. These results demonstrate that the antibody produced is really specific for hepatitis A virus and after that the technique can be standardized, it can be used for the immunofluorescence detection of the virus in sections of liver.
Databáze: Networked Digital Library of Theses & Dissertations
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