Caracterização inter e intra-específica de 45 estirpes elite de rizóbios microssimbiontes do feijoeiro baseada em análise polifásica

Autor: Juscélio Donizete Cardoso
Jazyk: portugalština
Rok vydání: 2009
Zdroj: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UELUniversidade Estadual de LondrinaUEL.
Druh dokumentu: masterThesis
Popis: Diversas espécies de bactérias do solo do gênero Rhizobium em simbiose com o feijoeiro (Phaseolus vulgaris L), apresentam a capacidade de formar nódulos efetivos e com isso fixar biologicamente o nitrogênio atmosférico (FBN) contribuindo para a redução no uso de fertilizantes nitrogenados nessa cultura. No Brasil, programas de pesquisa para seleção de estirpes de rizóbios têm buscado a eficácia e estabilidade das características da FBN. Porém, antes de uma avaliação da eficácia dessas bactérias em experimentos de campo, uma caracterização inter e intra específica é quase um exigência. Neste sentido, o estudo foi conduzido com o objetivo de realizar a caracterização de estirpes elite utilizando uma abordagem polifásica com base nas análises morfo-fisiológicas e genéticas. Nesse estudo, foram utilizadas, 45 estirpes elite de rizóbios microssimbiontes de feijoeiro, provenientes da Coleção de Microrganismos de Interesse do Agronegócio do Laboratório de Microbiologia do Solo do Instituto Agronômico do Paraná e três estirpes de Rhizobium tropici tipo B SEMIAs 4077, 4080 e 4088 (CIAT 899, PRF 81, H 12) autorizadas pelo MAPA para a produção de inoculantes para a cultura do feijoeiro, no Brasil. Os dados de morfologia de colônia, produção de ácido e melanina em meios de culturas específicos foram transformados em matriz binária e o agrupamento da dissimilaridade apresentado com base nas diferenças estimadas pela distância euclidiana. Através desse agrupamento, as estirpes foram distribuídas em dois grandes grupos, sendo que, o grupo I foi formado por 73% das quais três estirpes IPR-Pv tiveram 100% de similaridade com as estirpes de Rhizobium tropici (CIAT 899, PRF 81 e H 12). Na análise molecular, também, foram utilizadas as estirpes de R. tropici tipo A (CFN 299); R. leguminosarium bv phaseoli (ATCC10004); R. etli (CFN 42); R. giardini (H 152); R. galicum (R602sp). As análises de agrupamento dos produtos da amplificação com primers do RFLP-PCR-16S para análise inter especifica e do REP, BOX A1R-PCR para uma caracterização intra específica das estirpes foram realizadas usando o algoritmo UPGMA e o coeficiente de Jaccard. Pela técnica do PCR-RFLP do 16S rDNA foi observado um grupo contendo 34 estirpes IPR-Pv juntamente com as oito do genêro Rhizobium, enquanto a IPR-Pv 809 ficou isolada com baixa similaridade (3%). Através da análise do dendrograma com perfis de DNA obtidos por PCR-BOX, todas as estirpes analisadas apresentaram perfil distinto, com exceção de cinco pares de IPR-Pv que apresentaram 100% de similaridade. O agrupamento do PCR-REP com 70% de similaridade foi observado à formação de 20 perfis distintos e dentro desses ocorreram cinco subgrupos com 100% de similaridade. Através da análise polifásica verifica se que essas 45 IPR-Pv, embora pré selecionadas para eficácia simbiótica, apresentam alta diversidade feno-genotipica. Pelas análises moleculares verifica-se que o BOX-PCR é discriminatório de estirpe caracterizando cada uma, enquanto a do RFLP-PCR 16S RNAr dentro do gênero agrupa espécies.
Several soil bactéria that belong to genera Rhizobium when in symbiosis with common bean (Phaseolus vulgaris L) plants, present the ability to form effective nodule and to reduce nitrogen fertilizers by contribution by biological nitrogen fixation (BNF). In Brazil, research programs seeking for selection of rhizobial strains with efficiency and stability in higher BNF rates has been implemented. However, there is a need for a polyphasic characterization these strains based on morpho-physiological and molecular analysis before field evaluations on BNF. Thus, this study was carried out with the aim to characterize elite strains by using a polyphasic approach based on phenotypic and genotypic treats. Forty-five rhizobial elite strains from Coleção de Microrganismos de Interesse do Agronegócio do Laboratório de Microbiologia do Solo do Instituto Agronômico do Paraná, Rhizobium tropici IIB strains SEMIAs 4077, 4080 e 4088 (CIAT 899, PRF 81, H 12) autorized by MAPA for common bean crop in Brazil. Morpho-physiological data as colony characteristics, acid and melanin production on agar media were transformed to binary matrices and a cluster analysis based on Euclidean distance were done. By using the cluster analysis the strains formed two groups, the group I was comprised for 73% where three elite strains (IPR Pv) showed 100% of similarity with the inoculant authorized strains of Rhizobium tropici (CIAT 899, PRF 81 e H 12). For molecular analysis were used the same 45 elite, the SEMIAs and the type strains of R. tropici IIA (CFN 299); R. leguminosarium bv phaseoli (ATCC10004); R. etli (CF N42); R. giardini (H152); R. galicum (R602sp). The cluster analysis based on RFLP-PCR-16S, REP, BOX A1R-PCR polymorphisms were done by using the algorithm unweighted pair-group method with arithmetic mean (UPGMA) and coefficient of Jaccard (j). By using PCR-RFLP of 16S rDNA technique the cluster showed one group contained the 34 strains analysed togther with the type strains that belong to genera Rhizobium while the second had only the strain IPR-Pv 809. All strains characterized by PCR-BOX analysis presented distinct profile, except the five pairs of IPR-Pv, which showed 100% of similarity, probably the strains. The PCR-REP cluster analyses with 70% de similarity was observed 20 distinct profiles and within these groups occur five subgroups with 100% of similarity. It was observe that there is high pheno-genotypic diversity within these 45 IPR-Pv strains although they were originating from a subpopoulation selected for symbiotic efficiency. The BOX-PCR analysis is a sensible tool to characterize and to discriminate strain, while RFLP-PCR 16S RNAr is an analysis that allows forming groups based on genera and specie.
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