Validação de peptídeos miméticos recombinantes como ferramenta diagnóstica e vacinal para leishmaniose humana

Autor: Dias, Ana Carolina Soares
Jazyk: portugalština
Rok vydání: 2016
Předmět:
Zdroj: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFMAUniversidade Federal do MaranhãoUFMA.
Druh dokumentu: Doctoral Thesis
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Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPQ)
Fundação de Amparo à Pesquisa e ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico do Maranhão (FAPEMA)
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
Fundação de Apoio à Pequisa (FUNAPE)
Leishmaniasis is a neglected and endemic disease in Brazil, especially in the Northeast, caused by over 20 species of the Leishmania protozoan. Diagnosis includes epidemiological, clinical, and laboratory aspects. Despite the existence of various diagnostic techniques that can be used, none has 100% sensitivity and specificity. Hence, this study aimed to validate three recombinant mimetic peptides (LC1, LC2, and LT) obtained by Phage display, for the development of a specific, sensitive, rapid low-cost immunological diagnosis. Sera for detection of IgG from 223 individuals were used (123 with visceral leishmaniasis (VL), 45 with cutaneous leishmaniasis (CL) and 55 with LV-HIV coinfection). For cross-reaction tests, we used samples of patients with Chagas' disease (n = 60) and Malaria (n=65), and control group (n= 75 sera from newborns). The peptides were also tested in saliva from patients with LV (n = 65), with LT (n = 40), and healthy individuals from an endemic area were used as control (n =35). Diagnostic tests using the mimetic LC1 and LC2 peptides were carried out in serum of 15 asymptomatic subjects; 13 healed individuals and 15 healthy subjects. To test the ability of the mimetic peptides to improve the immune response against Leishmania, murine macrophages C57BL/6 were treated in vitro with peptides LC1, LC2, and LT (0,6μM; 1,25μM; 2,5μM; 5μM, 10μM) and infected with L. infantum chagasi and L. amazonensis for invasion and multiplication assays. We also evaluated the potential protective action of mimetic peptide in mice infected with L. amazonensis. Therefore, animals were immunized and the parasite load, expression of cytokines, lesion size, and protein analysis binders were evaluated. The immunoassays showed that both serum and saliva of the patients exhibited a highly significant difference (p < 0.0001) compared to their controls, with 100% sensitivity and 100%specificity. Peptides were able to detect infection in asymptomatic subjects and showed no cross-reactivity to either Chagas’ disease or malaria, as well as co-infection LV-HIV did not interfere with responsiveness to LV antibodies, therefore being a promising tool for monitoring regions where these diseases occur. Tests using macrophages showed a highly significant reduction in the number of infected cells and of internalized parasites. A further reduction of parasites with increasing concentration of peptide was observed. Furthermore, it was observed that immunization of mice was able to induce high levels of IFN-γ, IL-12, GM-CSF and IL-10, while IL-4 did not change compared to the control. Additionally, immunized animals showed a reduction in parasitic load in all organs (spleen, lymph node, liver, and bone marrow), a decrease in paw lesion in which parasites were inoculated and phosphorylation of ERK1/2, JNK and p65/RelA. Western Blot assay identified two proteins to L. amazonensis (42 KDa) and two to Leishmania infantum chagasi (26 KDa). Thus, our results demonstrate that mimetic peptides act as antigens of L. infantum chagasi and L. amazonensis, being good immune markers for a simple and fast diagnosis with high sensitivity and specificity. Finally, data in murine macrophages in vitro and in vivo open perspectives for their use as a vaccine tool.
Leishmaniose é uma doença negligenciada e endêmica no Brasil, especialmente na região Nordeste, sendo causada por cerca de 20 espécies do protozoário Leishmania. O diagnóstico abrange aspectos epidemiológicos, clínicos e laboratoriais. Apesar de existir várias técnicas diagnósticas que podem ser utilizadas, nenhum dos testes disponíveis apresenta 100% de sensibilidade e especificidade. Baseado nisto, este trabalho se propôs a validar três peptídeos recombinantes miméticos (LC1, LC2 e LT) obtidos por Phage display, para o desenvolvimento de um diagnóstico imunológico rápido, específico, sensível e de baixo custo. Foram utilizados soros para detecção de IgG em 223 indivíduos, sendo 123 com leishmaniose visceral (LV), 45 com leishmaniose tegumentar (LT) e 55 com coinfecção LV-HIV. Para testes de reação cruzada, foram utilizadas amostras de pacientes com Doença de Chagas (n = 60) e com Malária (n = 65) e, como grupo controle, foram utilizados soros de 75 de recém-nascidos. Os peptídeos também foram testados em amostras de saliva de 65 pacientes com LV e 40 pacientes com LT, tendo como grupo controle 35 indivíduos saudáveis de área endêmica. Foram realizados também testes diagnósticos utilizando os peptídeos miméticos LC1 e LC2 em soro de 15 indivíduos assintomáticos; 13 indivíduos curados e 15 indivíduos sadios. Com a finalidade vacinal, macrófagos murinos C57BL/6 foram tratados in vitro com peptídeos LC1, LC2 e LT (0,6μM; 1,25μM; 2,5μM; 5μM; 10μM) e infectados com L. infantum chagasi e L. amazonensis para ensaio de invasão e multiplicação. Foram também realizados ensaios para testar o potencial protetor do peptídeo mimético em camundongos infectados por L. amazonensis. Para tanto, os animais foram imunizados e avaliada a carga parasitária, expressão de citocinas, tamanho da lesão, e análise protéica de ligantes. Os ensaios imunoenzimáticos mostraram que tanto soro quanto saliva dos pacientes apresentaram diferença altamente significativa (p < 0,0001) em relação a seus controles, apresentando sensibilidade de 100% e especificidade de 100% para todos os peptídeos, tanto em soro quanto em saliva. Os peptídeos foram capazes de detectar infecção em indivíduos assintomáticos e não apresentaram reação cruzada com Doença de Chagas e Malária, bem como a coinfecção com HIV não interfere na reatividade com os anticorpos para L. infantum chagasi, sendo, portanto, uma promissora ferramenta para monitoramento da infecção em regiões endêmicas. Os ensaios com macrófagos mostraram uma redução altamente significativa no número de células infectadas e do número de parasitas internalizados. Observou-se maior redução de parasitas com o aumento da concentração dos peptídeos. Foi observado que a imunização de camundongos foi capaz de induzir níveis elevados de IFN-γ, IL-12 e GM-CSF, enquanto os níveis de IL-4 e IL-10 foram reduzidos. Além disso, os animais imunizados apresentaram uma redução da carga parasitária em todos os órgãos (baço, linfonodo, fígado e medula óssea), uma diminuição da lesão da pata na qual os parasitas foram inoculados e fosforilação das proteínas ERK1/2, JNK e p65/RelA. O ensaio Western Blot identificou duas proteínas de L. amazonensis (42 kDa) e duas para Leishmania infantum chagasi (26 kDa). Assim, os resultados demonstram que os peptídeos sintéticos mimetizam antígenos de L. amazonensis e L. infantum chagasi, revelando-se bons marcadores para diagnóstico imunológico de uso rápido, simples e, principalmente, com alta sensibilidade e especificidade. Finalmente, os dados em macrófagos murinos in vitro e in vivo abrem perspectivas para o uso desses peptídeos como ferramenta vacinal.
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