Caracterização molecular e funcional dos genes ras1 e ras2 do fungo dimórfico e patogênico Paracoccidioides Brasiliensis

Autor: Matos, Larissa Fernandes
Jazyk: portugalština
Rok vydání: 2007
Předmět:
Zdroj: Repositório Institucional da UnBUniversidade de BrasíliaUNB.
Druh dokumentu: Doctoral Thesis
Popis: Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2007.
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Paracoccidioides brasiliensis é um fungo termo-dimórfico que causa uma micose sistêmica de alta incidência na América Latina. Devido sua participação no controle de morfogênese, diferenciação e virulência em patógenos, decidiu-se caracterizar os genes ras em P. brasiliensis. Foram identificados ras1 e ras2 que codificam para duas proteínas diferentes com alta identidade. O padrão transcricional de ras também foi investigado por RT-PCR durante a transição micélio para levedura (M→Y), choque térmico a 42ºC e após internalização de leveduras em macrófagos murinos. Ambos os genes foram regulados negativamente em leveduras internalizadas em macrófagos e ras1 foi modulado negativamente a 42ºC. Entretanto, os genes ras não apresentaram variação transcricional durante a transição M→Y. O fato de que as proteínas Ras são localizadas na membrana através de farnesilação, permitiu a análise in silico dos genes que codificam para as subunidades das preniltransferases (farnesiltransferase e geranilgeraniltransferase I): ram1, ram2 e cdc43. P. brasiliensis apresenta em seu genoma todos os genes necessários para maquinaria de prenilação. Um inibidor de farnesiltransferase foi utilizado para investigar a importância desse processo no crescimento vegetativo e transição dimórfica. O bloqueio da farnesilação interferiu com o crescimento vegetativo de leveduras e estimulou a produção de tubos germinativos mesmo a 37ºC. Durante a transição Y→M, o inibidor aumentou a filamentação de maneira dosedependente, indicando que o bloqueio da farnesilação favorece a forma miceliana de P. brasiliensis. Os resultados sugerem que os genes ras devem ter um papel no dimorfismo, resposta a choque térmico e na interação patógeno-hospedeiro. Uma estratégia para estudar a função de ras1 em P. brasiliensis também foi desenhada através de interferência no RNA. Cassetes de silenciamento com ras1 senso e antisenso foram construídos para futura investigação detalhada do papel dos genes ras na patobiologia deste fungo. ___ ABSTRACT
Paracoccidioides brasiliensis is a thermo-dimorphic fungus that causes a human systemic mycosis with high incidence in Latin America. Due to their participation in the control of pathogen morphogenesis, differentiation and virulence the characterization of ras genes in P. brasiliensis was done. It was identified ras1 and ras2 coding for two different proteins with high identity. The ras transcriptional pattern was investigated by RT-PCR during mycelium-to-yeast (M→Y) transition, heat shock at 42ºC and after internalization of yeast cells by murine macrophages. Both genes were down regulated inside macrophages and ras1, at 42ºC. In contrast, the ras genes did not show any transcriptional variation during the M→Y transition. The fact that Ras proteins are attached to the membrane via farnesylation prompted the search on Pb gene database for the genes coding the subunits of the prenyltransferases (farnesyltransferase and geranilgeraniltransferase I): ram1, ram2 and cdc43. P. brasiliensis has all genes necessary to the prenylation machinary. Also, a farnesyltransferase inhibitor was used to investigate the importance that process to vegetative growth and dimorphic transition. Farnesylation inhibition interfered with vegetative growth of yeast cells and stimulated germinative tube production even at 37ºC. During Y→M transition the inhibitor increased filamentation in a dose-dependent manner, indicating that impairement of farnesylation favors the mycelium form of P. brasiliensis. The results suggest that ras genes might have a role in dimorphism, heat shock response and in host-pathogen interaction. A strategy to study the ras1 function in P. brasiliensis via RNA interference was designed. Cassettes with ras1 sense and antisense were constructed for further investigate in detail the possible roles of ras genes in this fungal pathogen.
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