Desintegrinas de Bothrops alternatus: biologia molecular, estudos in vitro, in vivo e bioinformática estrutural.
| Autor: | Ramos, Oscar Henrique Pereira |
|---|---|
| Jazyk: | portugalština |
| Rok vydání: | 2007 |
| Předmět: | |
| Zdroj: | Repositório Institucional da UFSCARUniversidade Federal de São CarlosUFSCAR. |
| Druh dokumentu: | Doctoral Thesis |
| Popis: | Made available in DSpace on 2016-06-02T20:20:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseOHPR.pdf: 2711129 bytes, checksum: 49ae21bbb3bc42024664100735c042db (MD5) Previous issue date: 2005-11-28 Universidade Federal de Minas Gerais Disintegrins are toxins frequently found in snake venoms. Their biological effects are due to their binding to cell receptors known as integrins. Aiming to isolate new disintegrins from Bothrops alternatus snake, a cDNA library was constructed upon the transcripts expressed in the venom gland from one specimen. Two disintegrins, called DisBa-01 and DisBa-02 were cloned and sequenced. The amplification of other medium-size disintegrins and metalloprotease-disintegrins was also achieved. The recombinant toxin, DisBa-01, was expressed in an optimized bacterial system (Escherichia coli BL21(DE3) pET28a+DisBa-01) and tested in several biological assays. The toxin inhibited the platelet aggregation (IC50= 235nM) induced by collagen in rabbit s platelets rich plasma (PRP). Using ADP as inductor, the platelet aggregation inhibition was also observed in PRP from rabbits (IC50= 124nM) and human (IC50= 475nM), as well as in washed platelets from mice (IC50= 25nM). Competition assays for the αIIbβ3 integrin using specific ligands, fibrinogen and a specific antibody against activated αIIbβ3, revealed that the toxin strongly binds to this receptor (respectively IC50=18nM and IC50=70nM). Furthermore, the toxin inhibited the proliferation of cells that representatively express αVβ3 integrin, HMEC-1 and B16F10-2B8, in a dose/time dependent manner and the adhesion of B16F10-2B8 to vitronectin (IC50= 225nM). In vivo, the toxin significantly inhibited the thrombus formation in arterioles (Treated: 58,4 ± 1,6 min.; Control: 24,3 ± 2,8 min., p Desintegrinas são toxinas frequentemente encontradas em venenos de serpentes e cujos efeitos biológicos relacionam-se com suas ligações a receptores celulares conhecidos como integrinas. Visando o isolamento de novas desintegrinas da serpente Bothrops alternatus, foi construída uma biblioteca de cDNA a partir de transcritos presentes nas glândulas veneníferas de um espécime dessa serpente. Duas desintegrinas, denominadas DisBa-01 e DisBa-02, foram clonadas e seqüenciadas. Também foi possível a amplificação de outras prováveis desintegrinas médias e metaloproteases-desintegrinas. A desintegrina, DisBa-01, foi expressa em um sistema bacteriano otimizado (Escherichia coli BL21(DE3) pET28a+DisBa-01) e testada em uma série de ensaios biológicos. A toxina recombinante inibiu a agregação plaquetária induzida por colágeno em plasma rico em plaquetas (PRP) de coelhos (IC50= 235nM). Utilizando ADP como indutor também se constatou a inibição da agregação plaquetárias em PRP de coelho (IC50= 124nM) e humano (IC50= 475nM), além da inibição da agregação de plaquetas lavadas de camundongos (IC50= 25nM). Em ensaios de competição pela da integrina αIIbβ3 na presença de ligantes específicos, obteve-se os IC50s de 18 e 70nM, respectivamente, para o fibrinogênio e para um anticorpo específico contra a integrina ativada. A toxina inibiu ainda a proliferação de células com expressão mais representativa de integrina αVβ3, HMEC-1 e B16F10-2B8, de maneira dose/tempo dependente, bem como adesão de células B16F10-2B8 à vitronectina (IC50= 225nM). In vivo, a toxina significativamente inibiu a formação de trombos em arteríolas (Experimental: 58,4 ± 1,6 min; Controle: 24,3 ± 2,8 min, p |
| Databáze: | Networked Digital Library of Theses & Dissertations |
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