Caracterização bioquímica de proteases do intestino de Anticarsia gemmatalis envolvidas no mecanismo de interação planta-inseto

Autor: Xavier, Luciana Pereira
Jazyk: portugalština
Rok vydání: 2002
Předmět:
Zdroj: Repositório Institucional da UFVUniversidade Federal de ViçosaUFV.
Druh dokumentu: masterThesis
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Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
A identificação e caracterização de proteases de intestino médio de insetos são importantes para o desenvolvimento de cultivares resistentes ao ataque de insetos. Neste estudo, a atividade proteolítica em intestino médio de larvas de A. gemmatalis foi investigada. O extrato enzimático foi obtido após ciclos de congelamento e descongelamento dos intestinos e posterior centrifugação do homogenato a 100,000 g, e o sobrenadante resultante (Fração I) foi utilizado como fonte de proteína solúvel. Como parte de nossos estudos, envolvendo a identificação de proteases do intestino médio de larvas de of A. gemmatalis, a presença de enzimas ligadas a membrana foi avaliada. Para este propósito, o precipitado do homogenato de intestino médio centrifugado a 100,000 g. foi ressuspendido em tampão com Triton X-100, centrifugado como anteriormente e o sobrenadante (Fração II) usado como fonte de proteases ligadas à membrana. A Fração I foi capaz de hidrolisar a caseína, e o substratos sintéticos L -BApNA e TAME. Usando L - BApNA como substrato, a atividade da Fração I foi investigada na presença de vários inibidores de proteases. Assim, EDTA, PMSF, TLCK, benzamidina e aprotinina, foram todos capazes de inibir a atividade da Fração I, com maior inibição observada com TLCK e benzamidina. De acordo com este resultados, conclui-se que o intestino médio de larvas de A. gemmatalis possui uma serino protease trpsina-like. Com o propósito de caracterizar melhor a atividade tripsina-like, foi determinada a atividade ótima para a Fração I. O pH ótimo foi de 8.5 e à temperatura ótima foi a 35 o C, sobre L -BApNA. O pH ótimo e temperatura foi de 8.0 e 30 o C, sobre TAME. O efeito de cálcio na atividade da Fração I foi investigado usando L -BApNA como substrato. A atividade máxima foi obtida na concentração de 20 mM de cálcio. Valores de K Mapp para L -BApNA e TAME foram de 0.32mM e 52.5μM, respectivamente. A Fração II foi capaz de hidrolisar a caseína, e os substratos sintéticos, L -BApNA e TAME. O efeito de vários inibidores de proteases também foi avaliado, usando L -BApNA como substrato. EDTA, PMSF, TLCK, benzamidina e aprotinina foram capazes de inibir a atividade da Fração II, com TLCK e benzamidina exibindo forte inibição. Estes resultados mostram que o intestino médio de larvas de A. gemmatalis possui proteases tripsin-like ligadas a membrana. Esta atividade tripsina-like foi melhor caracterizada. O pH ótimo para a Fração II usando L -BApNA e TAME foi 8.5 e 8.0, respectivamente. A atividade ótima exibida foi a 50 o C para ambos substratos, L-BApNA e TAME. Na concentração de 20 mM de cálcio, a Fração II mostrou um aumento na atividade sobre o L -BApNA. Os valores de K Mapp para L -BApNA e TAME foram de 0.23mM e 95.4 μM, respectivamente.
The identification and characterization of proteases from insects midgut are important in developing cultivars resistant to insect attack. In this study, proteolytic activities in the larval midgut of A. gemmatalis were investigated. Enzymatic extracts were obtained after frozen-and-thawed several times and centrifugation of the midgtus homogenate at 100,000 g, and the resulting supernatant (Fraction I) used as source of soluble proteins. As part of our studies involving the identification of proteases from midgut larvae of A. gemmatalis, the presence of the membrane-bound enzymes was evaluated. For this purpose, the pellet from midgut homogenates centrifuged at 100,000 g. was resuspended in buffer with Triton X-100, centrifuged as before and the supernatant (Fraction II), used as a source of membrane-bound proteases. Fraction I was able to hydrolyze casein, and the synthetic substrates, L-BApNA and TAME. Using L-BApNA as substrate, Fraction I activity was investigated in the presence of several protease inhibitors. Thus, EDTA, PMSF, TLCK, benzamidine and aprotinin, were all able to inhibit Fraction I activity, with greater inhibition observed with TLCK and benzamidine. According with these results, we conclude that the midgut larvae of A. gemmatalis have a trypsin-like serine protease. In order to further characterize the trypsin-like activities, the optimal activity for Fraction I was determined. The optimal pH was 8.5 and the optimal temperature was 35 o C, toward L-BApNA. Optimum pH and temperature were 8.0 and 30 o C, toward TAME. The effect of calcium on Fraction I activity was investigated using L-BApNA as substrate. The maximum activity was obtained at 20 mM calcium concentration. K Mapp values for L- BApNA and TAME were 0.32mM and 52.5μM, respectively. Fraction II was able to hydrolyze casein, and the synthetic substrates, L-BApNA and TAME. Also, the effect of several proteases inhibitors were evaluated, using L-BApNA as substrate. EDTA, PMSF, TLCK, Benzamidine and Aprotinin were able to inhibit Fraction II activity, with TLCK and benzamidine exhibiting stronger inhibition. These results showed that the midgut larvae of A. gemmatalis have a membrane-bound trypsin-like protease. These trypsin-like activities were further characterized. Optimum of pH for Fraction II activity using L-BApNA and TAME were 8.5 and 8.0, respectively. Optimal activity was exhibited at 50 o C toward L- BApNA and TAME. At 20 mM calcium concentration, Fraction II showed the highest activity toward L-BApNA. K Mapp values for L-BApNA and TAME were 0.23mM and 95.4 μM, respectively.
Dissertação importada do Alexandria
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