Detecção de Listeria monocytogenes em leite: sensibilidade e especificidade de Reação em Cadeia de Polimerase (PCR)

Autor: Nadia David Peres
Jazyk: portugalština
Rok vydání: 2007
Zdroj: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFMGUniversidade Federal de Minas GeraisUFMG.
Druh dokumentu: masterThesis
Popis: The aim of this work was to detect Listeria monocytogenes added in milk, after selective enrichment period, by PCR technique. A PCR technique using the primers LM1/LM2 and a multiplex PCR with IAP1/IAP2 e LMA/LMB was standardized. The conventional method of L. monocytogenes detection was compared from milk samples with different bacterial count added with various L. monocytogenes concentrations. The DNA extraction methods using phenolchloroform and thermal split were compared. The DNA extraction and the conventional methods showed the same result in detecting the bacterium in samples of sterilized milk. In milk samples with any initial contamination, the conventional methodology was sensitive and PCR from enrichment broth can not detect L. monocytogenes added, independently of the extraction method used. The identification time of L. monocytogenes decreased using the DNA extraction by the strain split method using suspect colonies that grew in Oxford and PALCAM, in substitution of identification phenotypes tests
O objetivo deste trabalho foi detectar Listeria monocytogenes inoculada em leite, após um período de enriquecimento seletivo, por meio da técnica de PCR. Foi feita a padronização de uma PCR utilizando os oligonucleotídeos LM1/LM2 e de uma PCR multiplex com os oligonucleotídeos IAP1/IAP2 e LMA/LMB. Listeria monocytogenes foi inoculada em várias concentrações em leite esterilizado desnatado e em leite cru integral com dois níveis diferentes de contaminação. A PCR padronizada foi aplicada para identificar a bactéria inoculada experimentalmente e foi comparada com o método convencional de detecção de L. monocytogenes. Foram comparados, também, os métodos de extração de DNA utilizando fenolclorofórmio e por lise térmica, a partir de um caldo de cultura e diretamente da colônia suspeita. Somente foi possível identificar L. monocytogenes por PCR no leite esterilizado desnatado, após 48 horas de enriquecimento em meio seletivo (LEB). Neste caso, a sensibilidade do teste foi de 1 UFC/ml de leite, a mesma sensibilidade da metodologia convencional. Quando inoculada em leite cru integral com contaminação bacteriana, L. monocytogenes só foi detectada pela metodologia convencional, com uma sensibilidade de até 2 UFC/ml (leite com baixa contaminação). Foi possível reduzir o tempo de identificação de L. monocytogenes, substituindo os testes fenotípicos de identificação pela PCR padronizada, utilizando DNA bacteriano extraído pelo método de lise térmica, diretamente da colônia suspeita
Databáze: Networked Digital Library of Theses & Dissertations
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