ВЫДЕЛЕНИЕ И АНАЛИЗ СТРУКТУРЫ МУТАНТНОЙ ФОРМЫ N-КОНЦЕВОГО КАТАЛИТИЧЕСКОГО МОДУЛЯ ТИРОЗИЛ-тРНК СИНТЕТАЗЫ BOS TAURUS С ЗАМЕНОЙ Trp 40 И Trp 87 НА АЛАНИН

Jazyk: ukrajinština
Rok vydání: 2021
Předmět:
Zdroj: Мікробіологія і біотехнологія; № 2(52) (2021); 27-39
Микробиология и биотехнология; № 2(52) (2021); 27-39
Microbiology&Biotechnology; No. 2(52) (2021); 27-39
ISSN: 2076-0558
2307-4663
Popis: Aim. Isolation and analysis of the structure of the mutant monotryptophan protein mini BtTyrRS for study of conformational changes of the enzyme at the stage of interaction with tRNA using fluorescence spectroscopy and determination of the effect of tryptophan residues in position 40 and 87 in its structure on the functional properties of the enzyme. Methods. Electrophoresis, metal-chelating affinity chromatography, fluorescence spectroscopy, spatial structure modeling. Results. It was found that the replacement of two codons of Trp by codons of Ala in the cloned cDNA mini BtTyrRS does not affect the synthesis of the mutant form of the enzyme in E. coli strain BL21 (DE3) pLysE. The yield of affinity purified protein on Ni-NTA agarose is on average 3.5 mg per 100 ml of culture medium. Computer modeling of the structure and fluorescence spectroscopy of the monotryptophan form of mini BtTyrRS indicates a compact structure of the mutant enzyme, in which Trp 283 is in an immobilized microenvironment. Conclusions. Affinity purified on Ni-NTA agarose mutant monotryptophan protein mini TyrRS have been obtained which is suitable for fluorescent studies of structural-dynamic and functional properties of the enzyme.
Цель. Выделение и анализ структуры мутантного однотриптофанового белка мини BtTyrRS для исследования с помощью методов флуоресцентной спектроскопии конформационных изменений фермента в процессе взаимодействия с тРНК и определения влияния остатков триптофана в положении 40 и 87 в его структуре на функциональные свойства энзима. Методы. Электрофорез, металл-хелатирующая аффинная хроматография, флуоресцентная спектроскопия, моделирование пространственной структуры. Результаты. Установлено, что замена двух кодонов аминокислоты триптофана на кодоны аминокислоты аланина в клонированной кДНК мини BtTyrRS не влияет на синтез мутантной формы фермента в штамме E. coli BL21 (DE3) pLysE. Выход аффинно очищенного на Ni-NTA агарозе белка составляет в среднем 3,5 мг с 100 мл культуральной среды. Компьютерное моделирование структуры и флуоресцентная спектроскопия однотриптофановой формы мини BtTyrRS указывают на компактную структуру мутантного фермента, в которой Trp 283 находится в иммобилизованном микроокружении. Выводы. Получен аффинно очищенный на Ni-NTA агарозе мутантный однотриптофановий белок мини BtTyrRS, пригодный для флуоресцентных исследований структурно-динамических и функциональных свойств фермента.
Мета. Виділення та аналіз структури мутантного однотриптофанового білка міні BtTyrRS для дослідження за допомогою методів флуоресцентної спектроскопії конформаційних змін фермента в процесі взаємодії з антикодоном тРНК та визначення впливу залишків триптофану в положенні 40 та 87 в його структурі на функціональні властивості ензиму. Методи. Електрофорез, метал-хелатувальна афінна хроматографія, флуоресцентна спектроскопія, моделювання просторової структури. Результати. Встановлено, що заміна двох кодонів амінокислоти триптофану на кодони амінокислоти аланіну в клонованій кДНК міні BtTyrRS не впливає на синтез мутантної форми фермента в штамі E. coli BL21(DE3)pLysE. Вихід афінно очищеного на Ni-NTA агарозі білка складає в середньому 3,5 мг з 100 мл культурального середовища. Комп’ютерне моделювання структури та флуоресцентна спектроскопія однотриптофанової форми міні BtTyrRS вказують на компактну структуру мутантного фермента, в якому Trp 283 знаходиться в іммобілізованому мікрооточенні. Висновки. Отримано афінно очищений на Ni-NTA агарозі мутантний однотриптофановий білок міні TyrRS, придатний для флуоресцентних досліджень структурно-динамічних та функціональних властивостей ензиму.
Databáze: OpenAIRE
Externí odkaz: