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Autophagie ist ein hoch kontrollierter intrazellulärer Prozess der für die Aufrechterhaltung zellulärer Homöostase in Eukaryoten essentiell ist. Durch die Interaktion von Autophagie spezifischen Proteinen, bekannt als Atg Proteine, kommt es zur Ausbildung eines Doppelmembran-Vesikels (Autophagosom), das sowohl unspezifisch als auch spezifisch zelluläre Komponenten in das Lysosom oder die Vakuole transportiert. Diese Komponenten können einerseits langlebige oder auch falsch gefaltete Proteine sein, andererseits wurde der spezifische Abbau von Organellen wie Mitochondrien oder Ribosomen beschrieben. Die Erforschung von Autophagie in dem Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae konnte bis heute zu den meisten Erkenntnissen in diesem Prozess führen. Bis heute konnten dadurch über 35 Signalweg-spezifische Proteine (Atg-Proteine) gefunden werden. Unter diesen wird der einzigen Kinase des Signalwegs - Atg1-Kinase - eine Schlüsselfunktion zugewiesen. Viele Forschungsgruppen arbeiten an der Identifizierung von Substraten der Atg1-Kinase sowie ihrer Regulation, es ist jedoch bis heute nur wenig darüber bekannt. Vor kurzem konnte die Konsensus-Sequenz der Kinase definiert werden. Dadurch konnten wir potenzielle Substrate identifizieren und ihre in vitro sowie in vivo Interaktion mit der Kinase testen. Innerhalb meiner Forschungsarbeit konnte ich einen kürzlich publizierten Protein-Protein Interaktionsassay in unserem Labor etablieren. Durch die Optimierung dieses Assays für die Detektion von transienten Interaktionen konnte ich die Interaktion der Atg1-Kinase mit einem ihrer Substrate in vivo nachweisen. Zusätzlich konnte ich durch Anwendung dieser Methode Interaktionen der Atg1-Kinase mit Atg-Proteinen die für die Entstehung der Autophagosomen notwendig sind, in vivo analysieren. Autophagy is a tightly regulated intracellular trafficking pathway that selectively or unselectively delivers portions of the cytoplasm to the degradative organelle of an organism. As cellular constituents such as misfolded proteins and aggregates or damaged organelles were described to be transported the lysosome/vacuole, autophagy is often seen as a quality control system of the cell. Moreover it ensures survival of cells exposed to unfavourable environmental conditions such as starvation by making available building blocks for essential metabolic functions. When the buddying yeast Saccharomyces cerevisiae faces nutrient-starvation a double-membrane vesicle called autophagosome is formed at the perivacuolar phagosome assembly site (PAS). The autophagosome enwraps cytosolic components and transports them to the yeast vacuole. In yeast over 35 AuTophaGy-related genes (ATG) required for one or more steps of autophagy have been identified. From several analyses in yeast it is believed that the most upstream unit functioning in autophagy is the Atg1 kinase and its regulators. Atg1 and a subset of these proteins form the PAS core complex, which is essential for the formation of autophagosomes. However, the composition of this complex as well as direct interaction among consisting proteins remain unclear. On one hand the in vivo interaction of proteins within the PAS core complex was addressed in this thesis. Therefore I established a recently published protein-protein proximity assay in the laboratory. Furthermore this assay was optimized for tracking transient protein interactions of endogenously expressed proteins. Thereby I was able to detect the interaction of Atg1 kinase with one of its substrates in vivo. Vorgelegt von: Larissa-Kristina Wilhelm Abweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des Verfassers Molecular Biotechnology Wien, FH Campus Wien, Masterarb., 2013 |
