Toxicidade celular da homocisteína sobre o processo de ossificação endocondral no desenvolvimento de membros

Autor: Bourckhardt, Gilian Fernando
Přispěvatelé: Universidade Federal de Santa Catarina, Nazari, Evelise Maria
Jazyk: portugalština
Rok vydání: 2017
Předmět:
Zdroj: Repositório Institucional da UFSC
Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC)
instacron:UFSC
Popis: Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2017. A ossificação endocondral durante o desenvolvimento requer constante aporte sanguíneo, o qual é mantido pela rede vascular embrionária. Níveis elevados de homocisteína (Hcy) têm propriedades vasculotóxicas, porém ainda não está claro como a Hcy interfere na formação de vasos sanguíneos na ossificação. O objetivo deste estudo foi investigar o efeito de níveis elevados de Hcy na ossificação endocondral durante o desenvolvimento dos membros de embriões de Gallus domesticus, sobretudo na formação de vasos sanguíneos, e o seu impacto na mineralização óssea e nas células mesenquimais em torno do molde cartilaginoso/ósseo. Para tal, embriões de G. domesticus foram tratados em E2 com 20 µmol D-L Hcy/50 µL solução salina e analisados em E6 e E10. Embriões do grupo controle foram tratados somente com 50 µL de solução salina. Inicialmente, não foram observadas diferenças nas células em proliferação e em apoptose entre embriões tratados com Hcy e embriões-controle, em E6 e E10. Não foram identificadas diferenças na área dos moldes cartilaginoso/ósseo entre os membros de embriões tratados com Hcy e embriões-controle. Em E6 e E10, houve uma redução significativa nos conteúdos de VEGF, VCAM-1 e NOS3 e osteocalcina em embriões tratados com Hcy. Nas análises ultraestruturais das células mesenquimais dos embriões em E6 tratados com Hcy foram observadas dilatações nas cristas mitocondriais e no lúmen do RER. Além disso, em embriões tratados com Hcy foi observado um aumento de 19,0% no número de perfis mitocondriais e uma redução no número de cisternas do RER. Nos embriões em E10 foram observadas apenas dilatações no lúmen do RER. No entanto, em E6 e E10 foi observado um aumento na área das cisternas do RER nos embriões tratados com Hcy. Nas células mesenquimais em E6, foi observado um aumento no conteúdo da proteína DRP1 (marcadora de fissão mitocondrial) e uma redução nos conteúdos das proteínas MFN1 e MFN2 (marcadoras de fusão mitocondrial) após o tratamento com Hcy. No entanto, em embriões E10 não foram encontradas diferenças no conteúdo de DRP1 e MFN1, enquanto que foi observado um aumento no conteúdo de MFN2. Nos embriões em E6 tratados com Hcy, foi observada uma diminuição nos conteúdos das proteínas Bak e Bcl2 nas células mesenquimais. Em E10, o tratamento com Hcy não alterou os conteúdos das proteínas Bak e Bcl2. Adicionalmente, o tratamento com Hcy induziu mitofagia nas células mesenquimais em embriões E6, reconhecida pelo aumento nos conteúdos das proteínas PRK8, LC3II e p62 (marcadoras de mitofagia). Por outro lado, em E10, o tratamento com Hcy induziu apenas redução no conteúdo de PRK8. Por último, em E6 e E10, o tratamento com Hcy induziu estresse no RER, identificado pelo aumento no conteúdo da proteína GRP78. Nossos resultados mostram que elevados níveis de Hcy interferiram na ossificação endocondral, promovendo a diminuição na formação de vasos sanguíneos no molde cartilaginoso e na matriz óssea. Além disso, o tratamento com Hcy desencadeou outros mecanismos de respostas celulares relacionados à sobrevivência, como a mitofagia e o estresse no RER no mesênquima durante o desenvolvimento de membros. Abstract : Developmental endochondral ossification requires constant blood supply, which is provided by the embryonic vascular network. High levels of homocysteine (Hcy) has vasculotoxic properties, but it remains unclear how Hcy disrupts blood vessel formation in ossification. The aim of this study was to investigate the effect of high levels of Hcy on endochondral ossification during limb development of Gallus domesticus embryos, especially in the blood vessels formation, and its impact on bone mineralization and in mesenchymal cells around the cartilage/bone molds. For this, G. domesticus embryos were treated at E2 with 20 µmol D-L Hcy/50 µL saline and analyzed at E6 and E10. Control embryos received exclusively 50 µL saline solution. First, no differences were observed in proliferating and apoptotic cells between Hcy-treated embryos and control embryos at E6 and E10. No differences were identified in the area of limb ossification in Hcy-treated and untreated embryos. At E6 and E10, there was a significant decrease in the contents of VEGF, VCAM-1, NOS3 and osteocalcin in Hcy-treated embryos. Ultraestructural analysis of mesenchymal cells of Hcy-treated embryos at E6, showed mitochondrial crest and RER lumen dilatations. Moreover, in Hcy-treated embryos, an increase of 19.0% on the number of mitochondrial profiles and a decrease on the number of RER cisterns were found. In embryos at E10, only dilatation of RER lumen was observed. However, at E6 and E10 an increase of the area of RER cisterns was observed in Hcy-treated embryos. In mesenchymal cells at E6, an increase in the content of DRP1 protein (mitochondrial fission marker) and a decrease in the contents of MFN1 and MFN2 proteins (mitochondrial fusion markers) were observed after treatment with Hcy. However, in embryos at E10 no differences were found in the contents of DRP1 and MFN1, while it was observed an increase in the content of MFN2. In Hcy-treated embryos at E6, a decrease in the content of Bak and Bcl2 proteins was observed in mesenchymal cells. At E10, Hcy treatment did not change the contents of Bak and Bcl2 proteins. Additionally, Hcy-treatment induced mitophagy in mesenchymal cells of embryos at E6, recognized by the increase on the contents of PRK8, LC3II e p62 proteins (mitophagy markers). On the other hand, at E10, Hcy-treatment induced only a decrease in PRK8 content. Finally, at E6 and E10, Hcy-treatment induced RER stress, identified by the increase of the content of GRP78 protein. Our results showed that high levels of Hcy interfered on the endochondral ossification, promoting a decrease of formation of blood vessels cartilage molds and bone matrix. In addition, Hcy-treatment triggered other mechanisms of cellular responses, related with as cell survival, such as mitophagy and RER stress on mesenchyme during limb development.
Databáze: OpenAIRE
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