Evaluation of the effect of redox and repair chemical inhibition of APE1/Ref-1 on gene transcription during inflammation

Autor: Oliveira, Thais Teixeira
Přispěvatelé: Oliveira, Riva de Paula, Pinto, Nadja Cristhina de Souza, Lima, Lucymara Fassarella Agnez
Jazyk: portugalština
Rok vydání: 2020
Předmět:
Zdroj: Repositório Institucional da UFRN
Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN)
instacron:UFRN
Popis: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq A proteína APE1/Ref-1 possui dois domínios funcionais em mamíferos. O domínio N-terminal é capaz de reduzir fatores de transcrição, tais como NF-kB, AP-1 e HIF-1, aumentando a capacidades destes de ligação ao DNA e a expressão de seus genes alvos. Já o domínio C-terminal é responsável pela atividade de endonuclease de APE1/Ref-1, que atua no reparo de sítios apurínicos/apirimidínicos (AP) durante a via BER. Devido a suas várias funções, APE1/Ref-1 é um potencial alvo terapêutico estudado principalmente em relação ao câncer. Recentemente, foi demonstrado que a presença de 8-oxoG, principal lesão oxidada no DNA, nos promotores de alguns genes pode resultar na indução da expressão gênica na presença de OGG1 e APE1/Ref-1. Sendo assim, APE1/Ref-1 também regula a expressão gênica de maneira dependente da sua função de reparo. Porém, o papel de cada uma das funções de APE1/Ref-1 sobre a regulação transcricional ainda não está completamente elucidado. Em um trabalho anterior do nosso grupo, foi observado através de RNAseq, que a inibição da atividade de endonuclease de APE1/Ref-1 por metoxiamina altera a expressão de diversos genes durante a inflamação assim como diminui a expressão de citocinas e quimiocinas em monócitos pré-tratados com LPS. Dessa forma, o objetivo desta pesquisa foi verificar quais outros genes têm sua expressão afetada pela inibição do reparo de sítios AP, assim como identificar através de ferramentas de bioinformática os possíveis reguladores e parceiros de APE1/Ref-1 nesta resposta. Para isso, o RNA-seq foi reanalisado utilizando ferramentas de bioinformática e bancos de dados atualizados. Adicionalmente, os genes diferencialmente expressos após o tratamento com metoxiamina foram analisados quanto às suas funções e aos possíveis reguladores de sua expressão. A análise do transcriptoma indicou que o tratamento com metoxiamina aumenta a expressão de genes relacionados à inibição da via mTORC1 e a poliubiquitinação de proteínas. Por outro lado, diminui a expressão de genes relacionados a progressão do ciclo celular, transcrição, expressão de genes mitocondriais, produção de prostaglandinas e sinalização via Toll-like independente de MyD88. Além disso, esses genes foram comparados com aqueles diferencialmente expressos após o tratamento com E3330 (inibidor específico da função redox) nas mesmas condições. Os principais reguladores dos genes comuns assim com seus alvos foram analisados quanto a sua expressão por meio de q-PCR e Western blot. Foi observado que tanto a função de reparo de APE1/Ref-1 quanto a função redox são capazes de diminuir a transcrição de genes alvos de NRF1, GABPA e ELK1. Esses genes estão relacionados à biogênese mitocondrial, processamento de rRNA e biogênese ribossomal. Além disso, foi observado que ambas as funções de APE1/Ref-1 diminuem de maneira semelhante a expressão de genes relacionados a biogênese mitocondrial, assim como também são capazes de diminuir a expressão de Myc. Por outro lado, a expressão de proteínas ribossomais foi principalmente afetada por E3330, enquanto a inibição do reparo de DNA foi capaz de diminuir a expressão do pré-rRNA 47S sem afetar o processamento deste RNA. Por fim, podemos concluir que ambas as funções de APE1/Ref-1 podem estar envolvidas na regulação de genes relacionados a biogênese mitocondrial, mas exercem papeis diferentes na regulação de genes relacionados ao processamento e transcrição do rRNA. APE1/Ref-1 is a protein that has two functional domains in mammals. The N-terminal domain is capable of reducing transcription factors, such as NF-kB, AP-1 and HIF-1 and increase its DNA binding capabilities and the expression of its target genes. The C-terminal domain, on the other hand, is responsible for the endonuclease activity of APE1/Ref-1, which is the main endonuclease of the base excision repair (BER) pathway that acts in the repair of apurine/apyrimidine (AP) sites. Due to this, APE1/Ref-1 is a potentially well-studied therapeutic target, especially in relation to cancer. Recently, it has been demonstrated that the presence of 8-oxoG, the main oxidized DNA damage, in the promoters of some genes can result in the induction of gene expression in the presence of DNA glycosylase OGG1 and APE1/Ref-1. Thus, APE1/Ref-1 also regulates gene expression in a manner dependent on its endonuclease function. However, the role of each of the APE1/Ref-1 functions on transcriptional regulation is not yet fully elucidated. In a previous work by our group, it was observed through RNAseq, that the inhibition of APE1/Ref-1 endonuclease activity by methoxyamine changes the expression of several genes during inflammation as well as decreases the expression of cytokines and chemokines in LPS-treated monocytes. Thus, the objective of this research was to verify which other genes have expression affected by the inhibition of AP repair, as well as to identify through bioinformatics tools possible regulators and partners of APE1/Ref-1 in this response. For this, RNA-seq was re-analyzed using bioinformatics tools and updated databases. In addition, the genes differentially expressed after treatment with methoxyamine were analyzed for their functions and possible regulators of their expression. The analysis of the transcriptome indicated that treatment with methoxyamine increases the expression of genes related to inhibition of the mTORC1 pathway and the protein polyubiquitination. On the other hand, it reduces the expression of genes related to cell cycle progression, transcription, expression of mitochondrial genes, biosynthesis of prostaglandins and Toll-like signaling independent of MyD88. In addition, these genes were compared with those differentially expressed after treatment with E3330 (specific inhibitor of redox function) under the same conditions. The main regulators of common genes as well as their targets were analyzed for their expression using q-PCR and Western blot. It was observed that both, the repair and redox function of APE1/Ref-1, are able to decrease the transcription of NRF1, GABPA and ELK1 target genes. These genes are related to mitochondrial biogenesis, rRNA processing and ribosomal biogenesis. In addition, it was observed that both APE1 / Ref-1 functions similarly decrease the expression of genes related to mitochondrial biogenesis, as well as being able to decrease Myc expression. On the other hand, the expression of ribosomal proteins was mainly affected by E3330, while inhibition of DNA repair was able to decrease the expression of the 47S pre-rRNA without affecting the processing of this RNA. Finally, we can conclude that both functions of APE1/Ref-1 may be involved in the regulation of genes related to mitochondrial biogenesis, but play different roles in the regulation of genes related to the processing and transcription of rRNA. 2021-05-06
Databáze: OpenAIRE
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