Funcionalidade de serina integrases no controle de interruptores genéticos em plantas

Autor: Gomide, Mayna da Silveira
Přispěvatelé: Coelho, Cíntia Marques, Rech Filho, Elíbio Leopoldo
Jazyk: portugalština
Rok vydání: 2020
Předmět:
Zdroj: Repositório Institucional da UnB
Universidade de Brasília (UnB)
instacron:UNB
Popis: Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Programa em Rede Multi-Institucional do Pró-Centro-Oeste de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biodiversidade, 2020. A biologia sintética tem sido caracterizada por abordagens interdisciplinares voltadas para o desenho e/ou reprogramação de sistemas biológicos. Fomenta a síntese de genomas completos ou reduzidos e o desenvolvimento de novas tecnologias de edição e de controle de expressão de genes que permitam o implemento de características desejadas. Desse contexto têm emergido os circuitos genéticos biológicos sintéticos que, baseados na álgebra binária dos circuitos eletrônicos, colocam partes genéticas sob um controle de entrada e saída (input-output) para a geração de interruptores (switches), portas lógicas e redes genéticas sintéticas. Um elemento chave para tais circuitos são as enzimas recombinases do grupo das serina integrases, que são capazes de reconhecer sítios attB/attP e inverter a sequência de DNA inserida entre eles de forma unidirecional. Assim, essas enzimas podem ser utilizadas como ferramentas para ativar e desativar a expressão gênica a partir da inversão de partes biológicas, como promotores, terminadores ou sequências codificadoras. Contudo, o número dessas proteínas completamente caracterizadas para aplicações em plantas é ainda reduzido. É, portanto, de interesse o incremento do número de integrases funcionais para permitir a construção de circuitos genéticos vegetais voltados para a aquisição de múltiplas características vantajosas. Desta forma, o objetivo deste estudo foi avaliar a funcionalidade de seis serina integrases (2, 4, 5, 7, 9 e 13) na ativação de interruptores genéticos unidirecionais em protoplastos de Arabidopsis thaliana. A construção dos interruptores envolveu desenho e síntese de um sistema de plasmídeos repórteres e plasmídeos para expressão das integrases. Os repórteres possuem a sequência codificadora do gene gfp ou a sequência promotora CaMV 35S invertidas e flanqueadas pelo sítio de reconhecimento das integrases. A saída do sistema é a fluorescência da proteína GFP. Ensaios baseados em cotransformação transiente foram realizados para validar a capacidade das serina integrases ativarem os interruptores pela inversão das partes genéticas. As células fluorescentes positivas resultantes foram avaliadas por microscopia e por citometria de fluxo. Para ativação da sequência codificadora de gfp, as integrases 13, 9 e 4 promoveram as maiores proporções de células GFP positivas. As já estabelecidas phiC31 e Bxb1, e a integrase 7 promoveram proporção intermediária e a integrase 2, baixa. Sob ação da integrase 5, não foi observada fluorescência. Para ativação do promotor, as integrases 2 e 4 levaram às maiores porcentagens de células com o repórter GFP. Análise molecular por PCR indicou que todas as integrases rotacionaram as partes genéticas, mesmo a integrase 5, que não apresentou resultado de ativação por medição da fluorescência do GFP. Análises por sequenciamento evidenciaram a formação dos sítios resultantes da recombinação, attL/attR, e a correta orientação do promotor e da sequência codificadora do gfp para todas as integrases. Ensaio de viabilidade celular mostrou que as integrases não têm atividade citotóxica. Os resultados obtidos demonstraram a funcionalidade das integrases testadas em um sistema de interruptor vegetal e podem embasar o desenvolvimento de circuitos genéticos sintéticos mais finamente regulados para controlar a expressão gênica em plantas. Synthetic biology has been characterized by interdisciplinary approaches aiming the design and/or reprogramming of biological systems. It promotes the synthesis of complete or reduced genomes and the development of new gene editing and gene expression control technologies that enable the implementation of desired characteristics. From this context synthetic biological genetic circuits have emerged that, based on the binary algebra of electronic circuits, place genetic parts under an input-output control for the generation of switches, logic gates and synthetic genetic networks. A key element in such circuits are the recombinases serine integrase enzymes, which are capable of recognizing attB/attP sites and unidirectionally reversing the DNA sequence inserted between them. Thus, these enzymes can be used as tools to activate and deactivate gene expression by inverting biological parts, such as promoters, terminators or coding sequences. However, the number of these fully characterized proteins for plant applications is still small. Therefore, it is of interest to increase the number of functional integrases to allow the construction of plant genetic circuits for the acquisition of multiple advantageous traits. Thus, the aim of this study was to evaluate the functionality of six serine integrases (2, 4, 5, 7, 9 and 13) in the activation of unidirectional genetic switches in Arabidopsis thaliana protoplasts. The construction of the switches involved design and synthesis of a system of reporter plasmids and integrase expression plasmids. Reporters have the gfp coding sequence (CDS) or the CaMV 35S promoter sequence inverted and flanked by the integrase recognition sites. The system output is GFP protein fluorescence. Transient cotransformation assays were performed to validate the ability of serine integrases to activate switches by inverting the genetic parts. The resulting positive fluorescent cells were evaluated by microscopy and flow cytometry. For gfp CDS activation, integrases 13, 9 and 4 promoted the highest proportions of GFP positive cells. The already established phiC31 and Bxb1, and integrase 7 promoted intermediate proportions, whilst integrase 2 resulted in lowest proportions of GFP positive cells. Under the action of integrase 5, no fluorescence was observed. For promoter activation, integrases 2 and 4 led to the highest percentages of cells with the GFP reporter. Molecular analysis by PCR indicated that all integrases rotated the genetic parts, including even integrase 5, which showed no activation result by measuring GFP fluorescence. Sequence analysis showed the formation of the resulting sites of recombination, attL/attR, and the correct orientation of the promoter and the gfp CDS for all integrases. Cell viability assays also showed that integrases are not cytotoxic. Taking together, the results obtained demonstrated the functionality of the tested integrases in a plant switch system and may support the development of finely tuned regulated synthetic genetic circuits to control gene expression in plants.
Databáze: OpenAIRE
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