Identification ofviruses in tomato by next generation sequencing
| Autor: | Martins, Thais Pereira |
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| Přispěvatelé: | Fernandes, Fernanda Rausch, Nagata, Alice Kazuko Inoue |
| Jazyk: | portugalština |
| Rok vydání: | 2016 |
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| Zdroj: | Repositório Institucional da UnB Universidade de Brasília (UnB) instacron:UNB |
| Popis: | Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia, 2016. O tomateiro é uma solanácea cultivada em várias partes do mundo, com fruto rico em compostos com propriedades antioxidantes e anticancerígenas. A tomaticultura está sujeita a várias doenças que podem limitar sua produção, diversos vírus têm sido descritos e estão amplamente disseminados nos campos de produção. As viroses estão dentre as doenças de maior importância, pois são de difícil controle e não existem produtos anti-virais disponíveis no mercado. A diagnose das espécies virais é realizada comumente por técnicas tradicionais e modernas, testes sorológicos como o ELISA e testes moleculares como a RT-PCR e a PCR são utilizados para detecção de patógenos previamente caracterizados. As limitações dessas técnicas aparecem quando se trata da detecção e identificação de um novo vírus. Identificar o agente causador de uma nova doença, onde não se tem informações sobre a morfologia, composição ou características químicas e físicas do patógeno, utilizando tais técnicas juntamente com microscopia eletrônica constitui uma tarefa difícil que pode demorar meses ou anos. Devido a essas dificuldades, novas abordagens para melhorar a identificação dos agentes causadores de novas doenças foram desenvolvidas. A abordagem metagenômica utilizando o método de Sanger gerou uma série de realizações importantes, porém, ao final do século XX, o sequencimento de alto desempenho (Next generation sequencing – NGS) foi lançado para suprir as limitações desse método. O sequenciamento de alto desempenho sequencia massalmente a população de ácidos nucleícos presentes em uma amostra, gerando sequências curtas de uma ou de ambas as extremidades, conhecidas como reads. O advento dessa forma de sequenciar transformou os estudos metagenômicos de grande escala em procedimentos práticos e de baixo custo. Com o objetivo de conhecer a população viral (viroma) e de obter genomas virais completos ou parciais, o sequenciamento de alto desempenho foi implementado para detectar patógenos virais em tomateiros de Brazlândia (DF), Campinas (SP) e Araguari (MG). Amostras de tomateiros que apresentavam sintomas típicos de infecções virais foram coletadas e agrupadas em cinco amostras compostas: BRAZ, com plantas de Brazlândia e AHOL, TOCA1, TOCA2, com plantas de Campinas e CAM-RNY2, com plantas de Araguari. As amostras compostas foram submetidas ao processo de semi-purificação de partículas virais, à extração de RNA e posteriormente foram enviadas para sequenciamento na plataforma Illumina HiSeq2000, na Macrogen (Coréia do Sul). Diversos vírus de ocorrência habitual nos campos de produção brasileiros foram detectados: os tospovírus Groundnut ringspot virus, o Tomato spotted wilt virus; o tobravírus Pepper ringspot virus; o crinivírus Tomato chlorosis virus; os begomovírus Sida micrantha mosaic virus e o Tomato severe rugose virus; o tymovírus Tomato blistering mosaic virus; e os potyvírus Pepper yellow mosaic virus e Potato virus Y. O Pepper mild mottle virus foi detectado como um resultado inesperado, devido à predominância de tobamoviroses causadas por Tomato mosaic virus em tomateiro. Dois contigs da amostra BRAZ geraram suspeitas de existência de uma nova espécie de ilarvírus, devido a sua baixa identidade com Ageratum latent virus e Parietaria mottle virus. O amalgavírus Southern tomato virus foi detectado em todas as bibliotecas e dois genomas semi-completos foram montados (STV-DF e STV-MG). Esses genomas mostraram alta identidade de nucleotídeos entre si e com os demais isolados de STV depositados no banco de dados. O STV é um vírus de RNA fita-dupla de aproximadamente 3,5 Kbp, pertencente ao gênero Amalgavirus, que foi descrito na América do Norte (Estados Unidos e México). Não há evidências de transmissão mecânica ou por enxertia desse vírus, porém, estudos anteriores confirmaram elevadas taxas de transmissão vertical (70% – 90%). Os relatos desse vírus têm crescido nos últimos anos, foi relatado também na França, na Espanha, na China, na Itália e em Bangladesh. A detecção sempre em co-infecção com outros vírus e a ausência de sintomas em plantas positivas para o vírus gerou dúvidas a respeito de sua patogenicidade, porém sua alta taxa de transmissão vertical e a expansão de sua distribuição gerou preocupações para a indústria do tomate. Maiores estudos são necessários para definir o efeito de sua presença em lotes de sementes comerciais e o seu potencial de patogenicidade. Com o objetivo de caracterizar o isolado de STV encontrado no Brasil, a presença desse vírus foi confirmada e foi realizado um estudo filogenético, além da detecção por RT-PCR em plantas coletadas no campo e em sementes comerciais de tomateiro utilizando dois pares de primers. Todas as amostras compostas originais testadas apresentaram resultados positivos para RT-PCR, com ambos os primers. A clonagem e sequenciamento de fragmento gerado a partir da amostra BRAZ possibilitou a obtenção dos nucleotídeos faltantes na sequência STV-DF. A análise filogenética da RNA polimerase pelo método da máxima verossimilhança, mostrou agrupamento dos isolados de STV-DF e STV-MG com as demais sequências de STV. Os isolados de STV permaneceram próximos a outros vírus pertencentes à família Amalgaviridae, que se mostraram mais próximos dos vírus da família Partitiviridae que do vírus pertencente à família Totiviridae. O vírus foi detectado em amostras coletadas em Brazlândia e Taquara (DF), em São José do Rio Preto (SP), em Corúmba de Goiás, Morrinhos e Goianápolis (GO) e em Reserva (PR) As plântulas testadas das cultivares Predador, Santa Clara, H-9992 e H-9553 também apresentaram resultados positivos para infecção por STV. A alta similaridade entre os isolados de STV encontrados e os existentes e a detecção desse vírus em plântulas de sementes comerciais indicam uma provável introdução do vírus através de materiais vegetais importados. Aproximadamente um sétimo dos vírus de plantas conhecidos são transmitidos por sementes de pelo menos uma espécie vegetal por ele infectada. A detecção desse vírus em plântulas oriundas de sementes comerciais demonstra a fragilidade do controle do material vegetal que entra no país. Quatorze países exportam sementes de tomate para o Brasil sem a análise de risco de pragas por estarem autorizados pelo MAPA. Embora a importação seja importante para a economia do país, a ineficiência das medidas fitossanitárias para autorizar a entrada das sementes pode trazer consequências desastrosas para agricultura brasileira. The tomato is a solanaceous plant, rich in substances with antioxidant properties, and which is cultivated in several regions of the world. Susceptible to infection by different viruses, the tomato production has serious risks that limit its production. Viruses are among the most important diseases because of the difficulty in their control. The diagnosis of viral species is commonly carried out by traditional and modern techniques, such as serological and molecular tests such as PCR or RT-PCR, which are used to detect previously characterized pathogens. These tools have limitation in cases when there is a need for detection and identification of unknown viruses. The identification of the etiological agent of a new disease, i.e. without information on particle morphology, genome composition and chemical and physical properties, starting from electron microscopy, is a difficult task that can take months or years to accomplish. To circumvent these difficulties, new techniques were developed. The metagenomics approach, using the Sanger method, has generated a number of important achievements, but at the end of the 21st century, high-performance sequence was launched to overcome the limitations of this method. The Next generation sequencing (NGS) strategy enables the determination of sequences of the whole population of nucleic acids present in a sample, by generating sequences of one or both ends (named reads). The advent of this sequencing technique has transformed metagenomic studies of large-scale practical and with a low cost. In order to determine the viral population (virome) and assemble the complete or partial viral genomes present in tomato plants, high-performance sequencing has been implemented in plants collected in the regions Brazlândia (DF), Campinas (SP) and Araguari (MG). Tomato samples with typical symptoms of viral infections were collected and grouped into five composite samples: BRAZ, containing plants collected in Brazlândia; AHOL, TOCA1, TOCA2 from Campinas; and CAM-RNY2 from Araguari. The composite samples were subjected to the process of semi-purification of viral particles, extraction of RNA and sequencing on Illumina platform HiSeq2000 at Macrogen, Inc. (South Korea). Several viruses commonly found in Brazilian production fields were detected, such as tospovírus Groundnut ringspot virus and Tomato spotted wilt virus; the tobravírus Pepper ringspot virus; the crinivírus Tomato chlorosis virus; the begomovírus Sida micrantha mosaic virus and Tomato severe rugose virus; the tymovírus Tomato blistering mosaic virus; and the potyvírus Pepper yellow mosaic virus and Potato virus Y. The tobamovirus Pepper mild mottle virus was also detected, though this result was not expected due to the predominance of Tomato mosaic virus in tomato. Two contigs generated from BRAZ sample showed a proximity to the ilarvirus Ageratum latent virus and Parietaria mottle virus suggesting the presence of a new ilarvirus in the plants. The amalgavirus Southern tomato virus (STV) was detected in all libraries and two semi-complete genomes (STV-DF and STV-MG) were assembled. These genomes showed high nucleotide identity each other and among other STV sequences deposited in nucleotide databases. STV is a double-stranded RNA virus of approximately 3.5 kbp, belonging to the genus Amalgavirus, which was described in North America (United States and Mexico). There is no evidence for mechanical transmission or by grafting of this virus, however, previous studies have confirmed high vertical transmission rates (70% - 90%). The reports of this virus have increased in the last years, being reported in France, Spain, China, Italy and Bangladesh. Questions regarding its pathogenicity properties are unanswered since they are usually detected in co-infection with other viruses and because of the absence of symptoms in positively infected plants. Its high rate of vertical transmission and the expansion of its worldwide spread are of big concerns for the tomato industry. Further studies are needed to define the effect of their presence in batches of commercial seeds and its potential for pathogenicity. In order to characterize the STV isolates found in Brazil, the presence of this virus has been confirmed and we performed a phylogenetic study, in addition to the RT-PCR using two primer sets, detection in plants collected in the field and in commercial tomato seeds. The original composite test samples were all positive for RT-PCR with both primer sets. The gap on the STV NGS-sequence from Brazlândia was filled by cloning and sequencing of an RT-PCR amplified fragment. The phylogenetic analysis of the RNA-dependent RNA polymerase gene by the maximum likelihood method showed grouping of STV-DF and STV-MG sequences with other STV sequences reported throughout the world. The STV sequences were closely related to viruses of other genus within the family Amalgaviridae, and to those of Partitiviridae than to those of Totiviridae. The virus was detected in new samples from Brazlândia and Taquara (DF), in São José do Rio Preto (SP), in Corumba de Goiás, Morrinhos and Goianápolis (GO), and Paraná (PR). Seedlings tested for the detection of STV of the cultivars Predator, Santa Clara, H-9992 and H-9553 were positive. The high identity among the isolates and the high incidence rate of STV in seeds indicate a possible introduction of the virus from the tomato seeds. Approximately one in seven known plant viruses is transmitted by seeds of at least one plant species. The detection of this virus in commercial seed seedling demonstrates the fragility in the control system of importation of plant materials. Fourteen countries export tomato seeds to Brazil without the need of risk analysis of pests because they are authorized by MAPA. Although this importation is important for the tomato production chain, the inefficiency of phytosanitary regulation system by authorizing the entry of contaminated seeds can have disastrous consequences for the Brazilian agriculture. |
| Databáze: | OpenAIRE |
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