Micropropagação, dinâmica da metilação e micorrização de Dendrocalamus asper (Poaceae: Bambusoideae)
| Autor: | Araújo, Fernanda Duarte |
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| Přispěvatelé: | Souza, Francisco Adriano de, Scherwinski-Pereira, Jonny Everson |
| Jazyk: | portugalština |
| Rok vydání: | 2020 |
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| Zdroj: | Repositório Institucional da UnB Universidade de Brasília (UnB) instacron:UNB |
| Popis: | Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Tecnologia, Departamento de Engenharia Florestal, Programa de Pós-Graduação em Ciências Florestais, 2020. Este trabalho teve por objetivo desenvolver um protocolo de micropropagação, analisar a dinâmica de metilação do DNA durante a multiplicação das plantas, bem como a capacidade de micorrização in vitro e ex vitro das plantas, verificando o efeito de substratos e a adaptação anatômicas durante a aclimatização de mudas micropropagadas de Dendrocalamus asper. No primeiro capítulo foi realizada a micropropagação, onde testou-se as citocininas (CK) 6-benzilaminopurina (BAP), cinetina (Kn) e meta-Topolina (mT) em diferentes concentrações. Em cada um dos três subcultivos, realizou-se o acompanhamento da metilação do DNA do material em cultivo. Após a etapa de multiplicação in vitro, as plantas foram aclimatizadas em casa de vegetação e, para a micorrização in vitro, inicialmente a concentração de fósforo (KH2PO4) do meio de MS (Murashige & Skoog) foi reduzida à 0%, 25%, 50%, 75% e 100% da sua concentração original. Além disso, também se comparou a micorrização utilizando-se o meio MSR (Medium Strullu-Romand) em sua concentração original de fósforo do referido meio. Neste experimento foram considerados dois tratamentos controle sem inoculação: (1) o meio de MS original, suplementado com 1,5 mg/L de Metatopolina e; (2) o meio MSR original. Num segundo experimento, com o intuito de aumentar a taxa de colonização das raízes, o experimento da micorrização in vitro foi realizado nas mesmas condições do anterior. No entanto, foi modificado os tratamentos de micorrização, sendo testado o (1) meio MSR completo, (2) o MSR com metade dos sais, (3) o MSR com metade dos sais, adicionados de 1,5 mg/L de carvão ativado, (4) o MS com metade dos sais e com apenas 0,4 % da concentração original de fósforo, (5) o MS com metade dos sais e 25% da quantidade total de sacarose, além do MS com metade dos sais adicionados de 1,5 mg/L de carvão ativado (6). Em ambos experimentos se utilizou o fungo micorrízico Rhizoglomus clarum como fonte de inóculo, o qual foi produzido em cultivo asséptico em sistema monoxênico em raízes Ri T-DNA de cenoura. Já num segundo capítulo, avaliou-se a micorrização ex vitro de mudas micropropagadas, a partir do uso de três substratos: 1) Bioplant® + areia (1:1 v/v); 2) Carolina Soil® + areia (1:1 v/v), e; 3) terra de subsolo. Aos substratos foram ainda combinados ou não o fungo micorrízico arbuscular (FMA) Rhizoglomus clarum, totalizando seis tratamentos. Antes do transplante das mudas para o ambiente ex vitro, elas foram mantidas em sala de cultura, em meio de MS suplementado com 1,5 mg/L de Metatopolina. Para verificar as adaptações anatômicas das mudas nos diferentes ambientes, amostras de folhas e raízes foram coletadas de plantas dos ambientes in vitro e ex vitro. Adicionalmente, mensurou-se a área foliar das plantas antes e durante a aclimatização. No capítulo de micropropagação, verificou-se que a citocinina mais eficiente para a multiplicação de D. asper foi a mT na concentração 13,3 μM, que proporcionou as maiores médias nos parâmetros avaliados (número de brotos, hastes, gemas, altura e taxa de multiplicação). De forma geral foi observado redução do número de brotos no terceiro subcultivo. A análise da metilação de DNA mostrou que o pico de metilação de DNA ocorreu no primeiro subcultivo, seguido de decréscimo gradual no segundo e terceiro ciclos de multiplicação, coincidindo com os resultados da metilação avaliados. No experimento de micorrização in vitro, constatou-se taxas de colonização de 16% das plantas em meio MSR. Nos demais tratamentos, não houve colonização. Apesar disso, não foram observados danos no desenvolvimento das plantas devido a redução do fósforo no meio de cultivo. Já no experimento de otimização, verificou-se taxas de colonização de até 25% das plantas nos tratamentos onde se utilizou o meio de MS com metade dos sais e com apenas 0,4 % da concentração original de fósforo, e naquele com MS na metade dos sais e 25% da quantidade total de sacarose. Os resultados indicam que a micorrização in vitro da espécie é possível, embora ajustes ainda devam ser realizados para garantir colonização mais ampla nas taxas de micorrização das mudas. Já nos experimentos do capítulo 2, a micorrização ex vitro e a colonização do fungo foi observada em 10% das plantas no substrato Bioplant®+Areia. Nos demais substratos não foram verificados indícios de colonização. Apesar disso, o substrato Carolina Soil®+Areia foi o que proporcionou a maior sobrevivência das mudas, com taxa de 100%, além de promover as maiores médias de altura das plantas em casa de vegetação. Com relação às análises anatômicas, verificou-se especialmente o incremento da espessura e área foliar e radicular das plantas em ambiente ex vitro em relação ao in vitro, indicando plasticidade adaptativa das plantas às novas condições ambientais. This work aimed to develop a micropropagation protocol, analyze the dynamics of DNA methylation during plant multiplication, as well as the in vitro and ex vitro mycorrhization capacity of plants, verifying the effect of substrates and anatomical adaptation during the acclimatization of micropropagated Dendrocalamus asper seedlings. In the first chapter, micropropagation was performed, where cytokinins (CK) 6-benzylaminopurine (BAP), kinetin (Kn) and meta-Topolin (mT) were tested at different concentrations. In each of the three subcultures, the DNA methylation of the material in culture was monitored. After the in vitro multiplication step, the plants were acclimatized in a greenhouse and, for in vitro mycorrhization, initially the phosphorus (KH2PO4) concentration of the MS medium (Murashige & Skoog) was reduced to 0%, 25%, 50%, 75% and 100% of its original concentration. In addition, mycorrhization was also compared using the MSR medium (Medium Strullu-Romand) in its original phosphorus concentration in that medium. In this experiment, two control treatments without inoculation were considered: (1) the original MS medium, supplemented with 1.5 mg/L of Metatopolina and; (2) the original MSR medium. In a second experiment, in order to increase the root colonization rate, the in vitro mycorrhization experiment was carried out under the same conditions as the previous one. However, the mycorrhization treatments were modified, being tested (1) the complete MSR medium, (2) the MSR with half the salts, (3) the MSR with half the salts, added with 1.5 mg/L of charcoal activated, (4) MS with half the salts and only 0.4% of the original phosphorus concentration, (5) MS with half the salts and 25% of the total amount of sucrose, in addition to MS with half the added salts of 1.5 mg/L of activated charcoal (6). In both experiments, the mycorrhizal fungus Rhizoglomus clarum was used as inoculum source, which was produced in aseptic cultivation in a monoxenic system on Ri T-DNA carrot roots. In a second chapter, the ex vitro mycorrhization of micropropagated seedlings was evaluated, using three substrates: 1) Bioplant® + sand (1:1 v/v); 2) Carolina Soil® + sand (1:1 v/v), and; 3) underground land. The substrates were also combined or not with the arbuscular mycorrhizal fungus (AMF) Rhizoglomus clarum, totaling six treatments. Before transplanting the seedlings to the ex vitro environment, they were kept in a culture room, in MS medium supplemented with 1.5 mg/L of Metatopolina. To verify the anatomical adaptations of seedlings in different environments, leaf and root samples were collected from plants in in vitro and ex vitro environments. Additionally, the leaf area of the plants was measured before and during acclimatization. In the micropropagation chapter, it was found that the most efficient cytokinin for the multiplication of D. asper was the mT at the concentration 13.3 μM, which provided the highest means in the evaluated parameters (number of shoots, stems, buds, height and rate of multiplication). In general, a reduction in the number of shoots was observed in the third subculture. The DNA methylation analysis showed that the DNA methylation peak occurred in the first subculture, followed by a gradual decrease in the second and third multiplication cycles, coinciding with the evaluated methylation results. In the in vitro mycorrhization experiment, colonization rates of 16% of plants were found in MSR medium. In the other treatments, there was no colonization. Despite this, no damage to plant development was observed due to the reduction of phosphorus in the culture medium. In the optimization experiment, colonization rates of up to 25% of the plants were verified in the treatments where the DM medium with half the salts and with only 0.4% of the original phosphorus concentration was used, and the one with DM in half. of the salts and 25% of the total amount of sucrose. The results indicate that in vitro mycorrhization of the species is possible, although adjustments still need to be made to ensure broader colonization in seedling mycorrhization rates. In the experiments in chapter 2, ex vitro mycorrhization and colonization of the fungus were observed in 10% of the plants in the substrate Bioplant®+Sand. In the other substrates, no signs of colonization were verified. Despite this, the Carolina Soil®+Areia substrate provided the greatest seedling survival, with a rate of 100%, in addition to promoting the highest average height of the plants in the greenhouse. Regarding the anatomical analyses, it was verified, in particular, the increase in thickness and leaf and root area of plants in an ex vitro environment compared to in vitro, indicating adaptive plasticity of the plants to new environmental conditions. |
| Databáze: | OpenAIRE |
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