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A L-asparaginase (LA) é uma enzima responsável por hidrolisar o aminoácido L-asparagina em ácido L-aspártico e amoníaco, e com aplicações na indústria farmacêutica como um biofármaco antileucémico, nomeadamente no tratamento da leucemia linfoblástica aguda, no tratamento do cancro da mama, ovários e cerebral. A LA pode ser produzida por bactérias, fungos ou leveduras por bioprocessos fermentativos. Atualmente, a LA comercializada para fins terapêuticos provém maioritariamente de Escherichia coli e Erwinia chrysanthemi. No entanto, a LA produzida por estes microrganismos apresenta também uma atividade de glutaminase intrínseca que pode provocar uma ativação do sistema imunológico, causando reações de hipersensibilidade, pancreatite, náuseas e anormalidades da coagulação. Desse modo, a busca por novos microrganismos que produzam a LA com efeitos colaterais reduzidos é de extrema importância. Nesta tese, produziu-se a LA por Bacillus subtillis recombinante, e otimizou-se o processo fermentativo, nomeadamente o momento de indução da produção da LA, a respetiva concentração do indutor (xilose) e a velocidade de agitação. Posteriormente, desenvolveu-se uma nova técnica de purificação para a LA, esta mais económica que os métodos convencionais existentes, através da utilização de líquidos iónicos suportados em sílica (LISS). Nesta etapa, a concentração de proteína total do extrato celular, a massa de LISS utilizada e o tempo de contato entre o extrato celular e o material foram otimizados. Com base nos resultados obtidos, as condições experimentais ótimas para a produção da LA são: densidade ótica de indução de 1,0 com 0,75 % (m/v) de xilose, e uma velocidade de agitação de 200 rpm após a indução. Quanto à purificação da LA utilizando LISS, os melhores resultados foram obtidos usando o extrato celular com uma concentração de proteína total de 18,5 mg/mL, 20 mg de LISS e 60 min de tempo de contato entre o material e o extrato celular. L-asparaginase (LA) is an enzyme, which hydrolyzes the amino acid L-asparagine into L-aspartic acid and ammonia. This enzyme has applications in the pharmaceutical industry as an anti-leukemic biopharmaceutical, namely in the treatment of acute lymphoblastic leukemia, the treatment of breast, ovarian, and brain cancers. LA can be produced by bacteria, fungi, or yeasts by fermentation bioprocesses. Currently, LA commercialized for therapeutic purposes is mainly produced from Escherichia coli and Erwinia chrysanthemi. However, the LA produced by these microorganisms also has an intrinsic glutaminase activity that can trigger an activation of the immune system, causing hypersensitivity reactions, pancreatitis, nausea, and coagulation abnormalities. Thus, the search for new microorganisms to produce LA with reduced side effects is extremely important. In this thesis we produced LA and optimized its production conditions by recombinant Bacillus subtilis, evaluating different factors of the fermentation process, namely the time of induction of LA production and the respective inductor (xylose) concentration and the stirring speed. Subsequently, we developed a new purification technique for LA, which is more economical than the existing conventional methods, using silica-based supported ionic liquids (SSIL). In this stage, the total protein concentration of the cell extract, the mass of SSIL used and the contact time between the cell extract and the material were optimized. Based on the results obtained, the optimal experimental conditions to produce LA are an induction optical density close to 1.0, with 0.75 % (m/v) xylose, and a stirring speed of 200 rpm. As for the purification of LA, the best results were obtained using the cell extract containing a protein total concentration of 18.5 mg/mL, 20 mg of LISS and 60 min of contact time between the material and the cell extract. Mestrado em Biotecnologia |
