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Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die Genexpression der Protein Phosphatase-gene TOPP1, TOPP2, TOPP5, STH1 und STH2 analysiert. Alle fünf ausgewählten Gene kodieren für PP des PP1/PP2A-Typs. Es wurde untersucht, ob homologen PP-Isoformen individuelle Expressionsmuster zugewiesen werden konnten. Besonderes Augenmerk richtete sich dabei auf die Expression von PP-Genen in den Schließzellen von A. thaliana. In mehreren Inhibitorstudien wurde beschrieben, dass PP1/PP2A-Proteine eine wichtige Rolle in der Signaltransduktion pflanzlicher Schließzellen spielen. Bisher konnte allerdings noch keine der entsprechenden katalytischen Untereinheiten auf molekularer Ebene identifiziert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde zum ersten Mal nachgewiesen, dass mit TOPP1 ein Protein des PP1-Typs präferenziell in den Schließzellen von A. thaliana exprimiert wird. Ein Vergleich der Genexpression von TOPP1, TOPP2 und TOPP5 zeigte für die drei homologen Gene sehr Isoform-spezifische Expressionsmuster. Dies war ein deutlicher Hinweis, dass diese eng verwandten PP trotz großer Übereinstimmung auf Aminosäureebene vermutlich unterschiedliche Funktionen in planta haben. Die Untersuchung der Genexpression von STH1 und STH2 zeigte, dass die fast identischen Proteine zum Teil in unterschiedlichen Geweben vorkommen. Die Transkripte der beiden Gene, welche eine eigene Untergruppe von PP2A-verwandten Sequenzen bilden, konnten aus EF isoliert werden. Der in dieser Arbeit entwickelte Screeningansatz ermöglichte es, die sehr ähnlichen cDNA-Fragmente eindeutig voneinander zu unterscheiden. Die gefundenen Isoform-spezifischen Expressionsmuster waren ein deutlicher Hinweis auf unterschiedliche Funktionen in planta. Zur weiteren Untersuchung der PP-Funktionen in planta wurden Pflanzen mit veränderter Genaktivität von TOPP2 oder STH1 untersucht. In Pflanzen mit RNAi-vermittelter Reduktion des TOPP2-Transkriptgehalts ließ sich ein deutlich verändertes Blattwachstum beobachten. Die eingerollten oder asymmetrisch entwickelten Blätter waren vermutlich ein Hinweis, dass diese PP1-Isoform auch in A. thaliana eine Rolle bei der Zellteilung spielt. Für TOPP2-Expression in Hefen wurde diese Funktion schon nachgewiesen. Die Analyse von Insertions-mutanten mit T-DNA Insertionen in beiden STH1-Allelen waren neben den Expressions-studien ein weiterer Hinweis, dass sich STH1 nicht funktionell durch STH2 ersetzen lässt. Die Experimente in dieser Arbeit zeigten, dass das Fehlen der STH1-Genaktivität zu einem deutlichen Blattphänotyp mit gezahnten Blatträndern führte. Für STH2-Insertionsmutanten wurde dieses veränderte Wachstum nicht beschrieben. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde das Gen NIC1, welches für ein MATE-Membranprotein kodiert, identifiziert und charakterisiert. Die Sequenzierung des Genoms von A. thaliana hatte gezeigt, dass mindestens 56 MATE-Gene in dieser Pflanze vorhanden sind. Zum Zeitpunkt der Identifikation von NIC1 war keines dieser Gene charakterisiert. Außer für das MATE-Protein ERC1 aus S. cerevisiae gab es keine Studien zu eukaryotischen Mitgliedern dieser großen Familie von Membranproteinen. Anhand NIC1 wurden heterologe Expressionssysteme zur funktionellen Charakterisierung von MATE-Proteinen aus Pflanzen etabliert. Die cDNA von NIC1 wurde nach ihrer Klonierung in X. laevis Oozyten und S. cerevisiae exprimiert. In S. cerevisiae erhöhte die NIC1-Expression die Lithumtoleranz der Hefen und führte zu einer Verminderung der Natriumtoleranz. Parallele Versuche mit NIC2 und NIC4 (in den Diplomarbeiten von Blazej Dolniak und Mandy Kursawe) zeigten, dass auch diese beiden Proteine die Salztoleranz von S. cerevisiae beeinflussten. Während NIC2 die Lithium- und Natriumtoleranz erhöhte, führte NIC4-Expresion zu einer höheren Sensibilität gegenüber diesen beiden Kationen. Die unterschiedlichen Eigenschaften der drei homologen Proteine zeigten sich auch bei ihrer Expression in X. laevis Oozyten. NIC1 induzierte in den Oozyten auswärts gerichtete Chloridströme, die spannungsabhängig waren und durch mikromolare Konzentrationen der trivalenten Kationen Lanthan oder Gadolinium inhibiert werden konnten. NIC4 induzierte Barium-inhibierbare Kaliumströme, die spannungsunabhängig waren. Für NIC2 ließ sich in diesem Expressionssystem keine Aktivität detektieren. Zur Untersuchung der NIC1-Funktion in planta wurde die Genaktivität in transgenen Pflanzen lokalisiert und reduziert. Die NIC1-Genexpression war hauptsächlich in den vaskulären Geweben der Pflanze detektierbar und einer Verminderung des NIC1-Transkriptgehalts beeinflusste die Entwicklungsgeschwindigkeit der Pflanzen. Sie entwickelten sich deutlich langsamer als der parallel kultivierte Wildtyp. Der deutliche Phänotyp bei Veränderung der Genaktivität von nur einem der mindestens 56 vorhandenen MATE-Gene in A. thaliana zeigte, dass vermutlich keine weitere MATE-Isoform in der Lage ist, die Funktion von NIC1 zu übernehmen. Gene expression analysis of the protein phosphatase (PP) genes, TOPP1, TOPP2, TOPP5, STH1 and STH2, of Arabidopsis thaliana was investigated in the first part of this thesis. All five genes encode PP of subgroups PP1 or PP2A. It was determined that homologous isoforms show individual and differing expression patterns. The PP-expression in guard cells was analysed further, because previous inhibitor studies showed an important influence of PP1/PP2A on signal transduction processes in these specialised cells. The previous studies had not addressed molecular identification of the inhibited PP1-/PP2A-subunits. This work demonstrates for the first time a preferential expression of a PP1 isoform, TOPP1, in guard cells. Further analysis of TOPP1, TOPP2 and TOPP5 gene expression also revealed isoform-specific expression patterns, suggesting non-redundant functions in planta. Characterisation of the nearly identical PP2A-related genes, STH1 and STH2, also revealed individual expression patterns. An established screening approach (this work) for the identification of PP-genes from EF (epidermal fragments; a preparation enriched for guard cells) made it possible to distinguish the cDNAs of STH1 and STH2. The two genes form a subgroup of PP2A-related sequences. Differences in their expression patterns suggest that STH1 and STH2 have different functions in A. thaliana. The analysis of plants with altered gene expression of TOPP2 and STH1 gave further insights into the roles of individual PP isoforms. The RNAi-mediated reduction of TOPP2-expression led to changed morphology of leaves, which showed curling and asymmetric development. The reason for this phenotype is probably due to changes of the cell cycle in certain parts of the leaf. Previous studies have already shown that heterologously expressed TOPP2 complements yeast cell cycle mutants. The selection and characterisation of plants with insertions in both STH1-allels revealed the individual roles of STH1 and STH2 in planta. Although STH2 was not affected, plants developed an extreme phenotype with reduced growth and altered leave shape. Previous studies with STH2 loss-of-function mutants did not show this morphology. The second part of this thesis includes the identification and characterisation of a MATE (multidrug and toxic extrusion) membrane protein in plants. Described is NIC1, the first of at least 56 MATE proteins in A. thaliana. Indeed a study of the MATE protein, ERC1, of Saccharomyces cerevisiae was the only description of a eukaryotic member of this large family of membrane proteins. |
