Fluoreszierende π-konjugierte Polymerfarbstoffe für die Durchflusszytometrie

Autor: Berndt, Daniel
Přispěvatelé: Werz, Daniel B., Ebbinghaus, Simon
Jazyk: angličtina
Rok vydání: 2022
Předmět:
Popis: The application of spectrally unique, controllable, bright and water-soluble fluorescent dyes is inevitable for advanced analysis techniques in modern cellular biology. Multiparameter flow cytometry is a powerful tool for the characterization of mixed cell populations in life sciences. The cell populations are typically discriminated using fluorescent reagents, e.g. antibody-fluorophore conjugates which specifically detect cellular markers. The number of parameters which can be studied simultaneously strongly depends on the availability of reagents which can be differentiated by their spectral properties. In the present thesis, new series of water-soluble fluorescent polymer dyes were developed. The polymer dyes can be excited by a violet (405 nm) or ultra violet (355 nm) laser, that are commonly applied in flow cytometers while the individual dyes are differentiated by their unique emission spectra in respective detection filters. For these studies, polyethylene glycol substituted fluorene- and binaphthyl-based π conjugated polymers were synthesized. These polymers can be used either as fluorescent dyes on their own, or in combination with covalently bound small-molecule dyes to generate tandem dye constructs, based on Förster resonance energy transfer (FRET). In the latter case, excitation of the polymers (energy donors) is followed by excitation energy transfer towards the small-molecule dyes (energy acceptors) which show fluorescence at longer wavelength. Depending on the nature of the energy acceptor, the fluorescence emission can be tuned to exploit the full visible spectrum for multiparameter flow cytometric analysis, while having high energy transfer efficiencies (>90 %). While polyfluorene dyes were best suited for the violet laser, chiral binaphthyl-based polymers incorporating phenylene bandgap modifying units were characterized for their photophysical properties, revealing them as good dye candidates for the UV laser. Additionally, the enantiomerically pure polymers were analyzed by circular dichroism (CD) and circular polarized luminescence (CPL) spectroscopy to show their chiroptical behavior. Bioconjugation to recombinant antibodies for cell staining and subsequent analysis in flow cytometry, indicate the great potential of fluorene- and binaphthyl-based polymers as fluorescent dyes for immunofluorescence applications.
Die Anwendung spektral einzigartiger, kontrollierbarer, heller und wasserlöslicher Fluoreszenzfarbstoffe ist für fortgeschrittene Analysetechniken in der modernen Zellbiologie unumgänglich. Die Multiparameter-Durchflusszytometrie ist ein leistungsfähiges Instrument für die Charakterisierung gemischter Zellpopulationen in den Biowissenschaften. Die Zellpopulationen werden in der Regel mit fluoreszierenden Reagenzien unterschieden, z. B. mit Antikörper-Fluorophor-Konjugaten, die spezifisch zelluläre Marker erkennen. Die Anzahl der Parameter, die gleichzeitig untersucht werden können, hängt stark von der Verfügbarkeit von Reagenzien ab, die sich durch ihre spektralen Eigenschaften unterscheiden lassen. In der vorliegenden Arbeit wurden neue Serien von wasserlöslichen fluoreszierenden Polymerfarbstoffen entwickelt. Die Polymerfarbstoffe können durch einen violetten (405 nm) oder ultravioletten (355 nm) Laser angeregt werden, die üblicherweise in Durchflusszytometern verwendet werden, während die einzelnen Farbstoffe durch ihre einzigartigen Emissionsspektren in entsprechenden Detektionsfiltern unterschieden werden. Für diese Studien wurden mit Polyethylenglykol substituierte fluoren- und binaphthylbasierte π-konjugierte Polymere synthetisiert. Diese Polymere können entweder als eigenständige Fluoreszenzfarbstoffe oder in Kombination mit kovalent gebundenen niedermolekularen Farbstoffen zur Erzeugung von Tandem-Farbstoffkonstrukten auf der Grundlage des Förster-Resonanz-Energie-Transfers (FRET) verwendet werden. Im letzteren Fall folgt auf die Anregung der Polymere (Energiedonor) eine Übertragung der Anregungsenergie auf die niedermolekularen Farbstoffe (Energieakzeptor), die eine Fluoreszenz bei längerer Wellenlänge zeigen. Je nach Art des Energieakzeptors kann die Fluoreszenzemission so eingestellt werden, dass das gesamte sichtbare Spektrum für die Durchflusszytometrie mit mehreren Parametern ausgenutzt wird, wobei gleichzeitig eine hohe Energietransfereffizienz (>90 %) erreicht wird. Während sich Polyfluoren-Farbstoffe am besten für den violetten Laser eignen, wurden chirale Polymere auf Binaphthyl-Basis, die Phenylen-Bandlücken-modifizierende Einheiten enthalten, hinsichtlich ihrer photophysikalischen Eigenschaften charakterisiert, was sie als gute Farbstoffkandidaten für den UV-Laser ausweist. Zusätzlich wurden die enantiomerenreinen Polymere mittels Zirkulardichroismus (CD) und zirkular polarisierter Lumineszenz (CPL) analysiert, um ihr chiroptisches Verhalten zu zeigen. Die Biokonjugation an rekombinante Antikörper zur Zellfärbung und die anschließende Analyse in der Durchflusszytometrie zeigen das große Potenzial von Fluoren- und Binaphthyl-basierten Polymeren als Fluoreszenzfarbstoffe für Immunfluoreszenzanwendungen.
Databáze: OpenAIRE
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