Identificação e caracterização de um novo fator de transcrição, homólogo ao Azf1 de Saccharomyces cerevisiae, envolvido na regulação da expressão de celulases no fungo filamentoso Trichoderma reesei

Autor: Amanda Cristina Campos Antoniêto
Přispěvatelé: Roberto do Nascimento Silva, Gilberto Ubida Leite Braga, Fernanda Zanolli Freitas, María Eugenia Guazzaroni, Richard John Ward
Rok vydání: 2022
Zdroj: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
Universidade de São Paulo (USP)
instacron:USP
Popis: O fungo Trichoderma reesei é conhecido por sua elevada capacidade de secreção de enzimas celulolíticas que atuam degradando o polímero de celulose em moléculas de glicose, sendo este um ponto chave na produção do etanol de segunda geração. O presente trabalho tem por objetivo contribuir para o entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos no processo de desconstrução da biomassa por T. reesei através da identificação de novos fatores de transcrição associados a este processo. Para isso, foi realizado um screening de 14 fatores de transcrição potencialmente envolvidos com a degradação de biomassa e identificação do gene Tr103275, homólogo ao regulador Azf1 de Saccharomyces cerevisiae. Posteriormente, foi feita a construção de um mutante com deleção do gene azf1 em T. reesei. Durante o crescimento em celulose e bagaço de cana, o gene azf1 foi altamente expresso em T. reesei, ao passo que glicose reprimiu a expressão gênica desse fator de transcrição. A ausência de azf1 afetou o crescimento e a esporulação em T. reesei, uma vez que a linhagem mutante produziu esporos menores e em quantidade reduzida em relação ao parental. Além disso, a proteína TrAzf1 atua como um regulador positivo da expressão de enzimas holocelulolíticas, considerando que as os genes que codificam as CBHs, EGs, BGs e xyn4 foram down regulados no mutante Δazf1 em celulose e bagaço de cana. O sítio de ligação para TrAzf1 foi predito nesse trabalho através de análise de bioinformática. Para avaliar a interação de TrAzf1 com esse sítio de ligação no DNA, o motivo dedo de zinco de Azf1 recombinante foi obtido por expressão heteróloga em E. coli e utilizado nas análises de SPR. No entanto, a validação da interação fator de transcrição-DNA por SPR não foi conclusiva e outros experimentos devem ser realizados para validar o motivo de ligação de TrAzf1 em T. reesei. O papel de Azf1 na regulação da degradação da biomassa vegetal foi descrito, pela primeira vez, nesse trabalho. Esse fator de transcrição é um alvo em potencial para manipulação genética de T. reesei, visando o melhoramento da produção de enzimas holocelulolíticas por essa espécie. The fungus Trichoderma reesei is known for its high capacity in secrete cellulolytic enzymes that act in the degradation of the cellulose polymer into glucose molecules, being a key point in the production of second generation ethanol. The present work aims to contribute to the understanding of the molecular mechanisms involved in the process of biomass deconstruction in T. reesei through the identification of new transcription factors associated to this process. For this, we screened 14 transcription factors potentially involved in the degradation of biomass and identified the gene Tr103275, homologous to the Azf1 regulator of Saccharomyces cerevisiae. Posteriorly, a mutant strain with deletion of azf1 was obtained. During growth in cellulose and sugarcane bagasse, azf1 was highly induced in T. reesei, while glucose repressed the gene expression of this transcription factor. The absence of azf1 affected growth and sporulation in T. reesei, since the mutant strain produced less and smaller spores relative to the parental strain. In addition, we have shown that TrAzf1 acts as a positive regulator of the expression of holocellulolytic enzymes, whereas the genes coding for CBHs, EGs, BGs and xyn4 were down-regulated in the Δazf1 mutant in cellulose and sugarcane bagasse. The binding site for TrAzf1 was predicted in this work through bioinformatics analysis. To evaluate the interaction of TrAzf1 with this DNA binding site, the recombinant Azf1 zinc finger motif was obtained by heterologous expression in E. coli and used in the SPR analyzes. However, validation of the transcription factor-DNA interaction by SPR was not conclusive and other approaches should be performed to validate the binding motif of TrAzf1 in T. reesei. The role of Azf1 in regulating the degradation of plant biomass was described for the first time in this work. This transcription factor is a potential target for the genetic manipulation of T. reesei, aiming to improve the production of holocellulolytic enzymes by this species.
Databáze: OpenAIRE
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