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1. Zusammenfassung 1.1. Zusammenfassung Hintergrund: TTF-1 stellt einen sensitiven als auch hoch spezifischen Marker zur Diagnose von pulmonalen Adenokarzinomen und Schilddrüsenkarzinomen dar. (Boggaram 2009) In pulmonalen Adenokarzinomen wird TTF-1 in 62,5-90% der Fälle exprimiert. (Myong 2003; Moldvay et al. 2004) In der Routinediagnostik gibt es allerdings immer wieder Probleme bei der Differenzialdiagnose von TTF-1 negativen Fällen. Durch immunhistochemische TTF-1 Analyse pulmonaler Adenokarzinome konnte nachgewiesen werden, dass sich abhängig vom Differenzierungsgrad TTF-1 Expression und 5-Jahres-Überleben in den histologischen Untergruppen unterscheiden. (Sterlacci et al. 2012; Sousa et al. 2015) Ziel: Ziel der Studie war die diagnostische Sensitivität zur Erkennung pulmonaler Adenokarzinome zu steigern und mögliche Zusammenhänge zwischen TTF-1 mRNA- und Proteinebene zu korrelieren. Dazu untersuchten wir die TTF-1 mRNA mittels qRT-PCR anhand von 199 Feinnadel-mikrodissezierter Fälle. Methoden: Die Untersuchung von TTF-1 mRNA und Protein erfolgte mittels qRT-PCR und Immunhistologie (Klon: 8G7G3/1) in Formalin-fixiertem Paraffin-eingebetteten Tumorgewebe. Insgesamt untersuchten wir 51 azinäre (AC) und 50 solide (SOL) pulmonale Adenokarzinome. 49 pulmonale Plattenepithelkarzinome (SQCC) und 49 pulmonale Metastasen eines colorektalen Adenokarzinoms (pCRC) dienten als Kontrolle. Wir nutzten β2M als Haushaltsgen und die qPCR Human Reference Total RNA von Agilent als Kalibrator. Der spezifische Primer (Hs00968940_m1, ThermoFisher Scientific) wurde zur Reversen Transkription der TTF-1 RNA in cDNA angewandt. Der TTF-1 Status wurde anhand eines ▲▲CT -Schwellenwert in der ROC-Kurve bestimmt. Resultate: TTF-1 mRNA Expression ist am höchsten in AC und SOL. Die ▲▲CT -Werte belaufen sich auf bis 23x103. SQCC und pCRC zeigen signifikant niedrigere Werte auf. TTF-1 mRNA kann mit einer Sensitivität bzw. Spezifität von 82,2%/92,9% in pulmonalen Adenokarzinomen (Schwellenwert 300,14), 90%/85,7% in azinären Adenokarzinomen (Schwellenwert 238,25) und 58%/98% in soliden Adenokarzinomen (Schwellenwert 825,75) nachgewiesen werden. 64,7% der AC und 60% der SOL stellen sich auf Proteinebene als TTF-1 positiv dar. In 21,8% der AC und SOL (Schwellenwert 300,14) , 25,5% der AC (Schwellenwert 238,25) und 10% der SOL (Schwellenwert 825,75) ist TTF-1 Protein neg./mRNA pos. TTF-1 mRNA und Protein lässt sich in AC und SOL signifikant korrelieren, sowie einen starken bzw. mittleren positiven Effekt nachweisen (p Gesamtkohorte= 0,00; rS; Gesamtkohorte= 0,49; p azinäre Adenokarzinome=0,001; rS; azinäre Adenokarzinome=0,45; psolide Adenokarzinoma=0,00; rS;solide Adenokarzinoma=0,55). Es konnte zwischen azinären und soliden pulmonalen Adenokarzinomen kein Zusammenhang zwischen der Abnahme des Differenzierungsgrad und dem Abfall der TTF-1 Expression auf Protein-und mRNA-Ebene nachgewiesen werden (pmRNA=0,123;pProtein=0,684). Schlussfolgerung: Abhängig vom verwendeten Schwellenwert erlaubt die Quantifizierung von TTF-1 mRNA den Gewinn zusätzlich tumorspezifischer Informationen in 21,8%, 25,5% und 10% der TTF-1 negativen pulmonalen Adenokarzinome. Die Quantifizierung der TTF-1mRNA aus Formalin-fixiertem Paraffin-eingebettetem Gewebe kann als wertvolles diagnostisches Handwerkzeug zur möglichen Beschleunigung des klinischen Ablauf genutzt werden. Eine Zunahme der TTF-1 mRNA geht in pulmonalen Adenokarzinomen mit einer gesteigerten TTF-1 Proteinproduktion einher - und umgekehrt. Ein Zusammenhang zwischen der Abnahme des Differenzierungsgrad und dem Abfall der TTF-1 Expression ist nicht nachweisbar. 1.2 Abstract Background: TTF-1 is a sensitive and highly specific marker for the diagnosis of pulmonary adenocarcinoma and thyroid carcinoma. (Boggaram 2009) In pulmonary adenocarcinomas TTF-1 is expressed in 62,5-90% of the cases. (Myong 2003; Moldvay et al. 2004) Routine diagnostics frequently troubles with the differential diagnosis of TTF-1 negative cases. Grading according to predominant histologic architecture of pulmonary adenocarcinoma not only revealed different TTF-1 expression, but also distinct 5 year-survival. (Sousa et al. 2015; Sterlacci et al. 2012) Objective: The aim of this study was to enhance diagnostic sensitivity for the detection of primary pulmonary adenocarcinomas and to correlate possible links between TTF-1 mRNA and protein levels in pulmonary adenocarcinoma. Therefore we analysed TTF-1mRNA by qRT-PCR and needle microdissection in 199 cases. Methods: TTF-1 mRNA and protein were detected by qRT-PCR and immunohistochemistry (Clone: 8G7G3/1) in FFPE tumour tissues. Overall 51 acinar (AC) and 50 solid (SOL) pulmonary adenocarcinomas were analysed. 49 pulmonary squamous cell carcinomas (SQCC) and 49 pulmonary metastasis of colorectal adenocarcinomas (pCRC) served as controls. β2M served as housekeeping gene, qPCR human reference total RNA from Agilent as the calibrator. TTF‑1 RNA was reverse transcribed into cDNA using a specific reverse primer (Hs00968940_m1, ThermoFisher Scientific). TTF-1 status was determined by ROC-curve calculating a ▲▲CT threshold. Results: TTF-1 mRNA expression is highest in AC and SOL. The ▲▲CT values amount up to 23x103. SCC and pCRC show significantly lower values. TTF-1 mRNA shows a sensitivity and specificity of 82,2%/92,9% in pulmonary adenocarcinoma (threshold 300,14), 90%/85,7% in acinar adenocarcinoma (threshold 238,25) and 58%/98% in solid adenocarcinoma (threshold 825,75). TTF-1 protein is positive in 64,7% of the AC's and in 60% of the SOL's. 21,8% of AC and SOL (threshold 300,14), 25,5% of AC (threshold 238,25) and 10% of SOL (threshold 825,75) are TTF-1 protein neg./mRNA pos. In AC and SOL was a correlation between TTF-1 mRNA and protein by use of Spearman-rank-correlation exposed and a strong and intermediate positive effect calculated (p total cohort= 0,00; rS; total cohort= 0,49; p acinar adenocarcinoma=0,001; rS; acinar adenocarcinoma=0,45; psolid adenocarcinoma=0,00; rS;solid adenocarcinoma=0,55). There is no correlation between less differentiated adenocarcinoma and decrease of TTF-1 expression in acinar and solid adenocarcinoma (pmRNA=0,123;pprotein=0,684). Conclusion: Depending on the threshold used, the quantification of TTF-1 mRNA gives additional tumour specific information in 21,8%, 25,5% or 10% of the TTF-1 negative pulmonary adenocarcinomas. Thus, TTF-1 transcript quantification from FFPE tumour tissue can be considered as a valuable diagnostic tool, potentially accelerating clinical procedures. An increase of TTF-1 mRNA in pulmonary adenocarcinoma is associated with a raising TTF-1 protein production - and vice versa. The consistent TTF-1 expression in moderate-differentiated and less-differentiated pulmonary adenocarcinoma indicates that expression is not affected by the differentiation state. |
