Charakterisierung der transienten Repression von nanos in der frühen Oogenese von Drosophila melanogaster

Autor: Horn, Andreas
Rok vydání: 2021
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DOI: 10.5283/epub.46390
Popis: Zellhomöstase erfordert ein feines Gleichgewicht zwischen Stammzellerneuerung und Differenzierung. In der weiblichen Keimbahn von Drosophila melanogaster befinden sich zwei bis drei Keimbahnstammzellen an der Spitze des Germariums. Signalgebung durch das umliegende Gewebe definiert eine somatische Nische, welche die Differenzierung der Stammzellen verhindert. Nach mitotischer Teilung einer der Stammzellen verfolgen beide Tochterzellen unterschiedliche Zellschicksale: Eine der Zellen verbleibt in der somatischen Nische um somit einen konstanten Bestand an Stammzellen zu gewährleisten, während die andere Tochterzelle insgesamt vier Zellteilungen mit unvollständiger Zytokinese durchläuft, um schließlich eine 16-Zellzyste zu bilden, aus welcher sich schließlich die reife Oozyte entwickelt. Um den Differenzierungsprozess zu initiieren, muss die Produktion des Stammzellfaktors Nanos (Nos) transient unterdrückt werden. Hierfür bedarf es des Weibchen-spezifischen Regulationsfaktors Sex-lethal (Sxl) sowie drei weiterer Faktoren, Bag of marbles (Bam), Benign gonial cell neoplasm (Bgcn) und Meiotic P26 (Mei-P26), welche an die 3’ UTR von nos binden und somit seine Expression regulieren. Fehler in dieser Regulation führen zur Ausbildung eines Keimbahntumors und somit zur Sterilität. Trotz der Kenntnis der beteiligten Faktoren sind die molekularen Details der Regulation von nos bislang kaum untersucht und bekannt. Diese Arbeit zeigt, dass Bam und Bgcn sowohl unabhängig als auch im Zusammenspiel miteinander in der Lage sind, die Expression von Nos durch Abbau seiner mRNA zu unterdrücken. Für beide Proteine werden dabei Bereiche definiert, über welche Interaktionen mit weiteren Proteinen stattfinden können, um somit die RNA Degradation zu vermitteln. Außerdem wurden in Zusammenarbeit mit weiteren Laboren neue Erkenntnisse über die RNA-Bindeaktivität der Mei-P26 NHL Domäne errungen. So konnten sowohl die Anforderungen an die gebundenen RNA Sequenzen als auch entscheidend an der Bindung beteiligte Aminosäuren innerhalb des Proteins identifiziert werden. Zusätzlich konnten über moderne iCLIP Analysen weitere Gene identifiziert werden, welche Mei-P26 abhängig reguliert werden. Die Validierung dieser Zielgene ergab dabei nicht nur den ersten in vitro Beweis für eine direkte Beteiligung von Mei-P26 an der Regulation von Nanos, sondern zeigte auch, dass Mei-P26 die Expression von mRNAs sowohl negativ als auch positiv beeinflussen kann, eine Eigenschaft die so für noch kein verwandtes Protein gezeigt werden konnte. Insgesamt konnten somit in dieser Arbeit diverse biochemische Einblicke in die Funktionsweise der, an der Regulation von Nanos beteiligten, Proteine gewonnen werden und dadurch unser Verständnis dieses hochkomplexen Prozesses erweitert werden.
Tissue homeostasis requires a fine balance between germ cell maintenance and differentiation. In the female germline of Drosophila melanogaster two to three germline stem cells (GSCs) reside at the tip of the germarium. Signaling from the surrounding tissue defines a stem cell niche that prevents differentiation. After mitotic division of a GSC, the two daughter cells adapt different cell fates: one remains a GSC to replenish the pool of stem cells, the other undergoes four synchronous cell divisions with incomplete cytokinesis to generate a cyst of sixteen cells, one of which develops into the oocyte. To initiate this differentiation process, production of the stem cell factor Nanos (Nos) has to be transiently repressed. This requires the female-specific master regulator protein Sex-lethal (Sxl), as well as three other proteins, Bag of marbles (Bam), Benign gonial cell neoplasm (Bgcn) and Meiotic P26 (Mei-P26), which bind and repress the nos mRNA. Failure to do so results in the formation of germ line tumors and sterility. Despite knowing the components involved, molecular details of this regulation are still poorly analyzed and understood. This thesis shows that Bam and Bgcn can both individually and cooperatively prevent Nos expression by degrading its mRNA. For both proteins, areas are defined which may interact with other proteins to allow RNA degradation. Furthermore, collaborative efforts with other laboratories granted advanced insights into the RNA binding properties of the Mei-P26 NHL domain, defining RNA sequence requirements as well as amino acids required for nucleotide binding. In addition to that, state of the art iCLIP analysis was used to identify additional targets of Mei-P26 mediated regulation. Validation of these targets not only for the first time provided in vitro evidence for a direct involvement of Mei-P26 in nos regulation, but surprisingly also showed that regulation by Mei-P26 can be both negative and positive, a behavior that has never been shown for any related proteins. In total, this thesis provides numerous biochemical insights into the function of proteins, involved into the transient repression of Nanos in the female germline, thus further expanding our molecular understanding of this highly complex process.
Databáze: OpenAIRE
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