Wirkstoffträgersysteme basierend auf bolaamphiphilen Lipiden zur topischen photodynamischen Therapie von Infektionen

Autor: Goergen, Nathalie Andrea
Přispěvatelé: Bakowsky, Udo (Prof. Dr.)
Jazyk: němčina
Rok vydání: 2021
Předmět:
DOI: 10.17192/z2021.0046
Popis: Within the scope of the present doctoral thesis, novel drug carrier systems based on naturally occurring and synthetic bolaamphiphiles for antimicrobial photodynamic therapy (aPDT) against bacteria and fungi were generated, characterized and first in vitro tests were carried out. The aim of this work was the development of stable carrier systems, which allow adequate therapy while being skin and mucous membrane compatible. Chapter 1 introduced the topic with an explanation of the problem of increasing antibiotic resistance in chronic wounds and mucosal infections caused by yeast, while simultaneously an adequate therapy and wound management is not available. Photodynamic therapy (PDT) was presented as a possible solution, highlighting the advantage of drug delivery systems made from bolaamphiphiles. The first chapter was followed by a summary and explanation of the manufacturing and characterization methods used in this work (chapter 2). Chapter 3 addressed the production and characterization of both drug delivery systems. First, the natural bolaamphiphilic lipids (tetraether lipids - TEL) were successfully extracted from the freeze-dried biomass of Sulfolobus acidocaldarius. By adding the phospholipid DSPC in various proportions, stable vesicular phospholipid gels (VPGs) were developed. These were characterized by means of scanning electron microscopy (SEM), cryo-transmission electron microscopy (cryo-TEM) and rotational viscosimetry. SEM images showed differences between the native carrier system and those with incorporated methylene blue (MB). VPG produced with DSPC:TEL (50:50) without drug showed a phase separation of the system, which could be confirmed by cryo-TEM examinations. Cryo-TEM pictures were carried out with the VPGs diluted to 2 mg/mL and, as expected, showed the structures phospholipids and TEL form spontaneously in aqueous media. An increase in the vesicle size with increasing proportions of added TEL was observed. In contrast to the other systems, DSPC:TEL (50:50)-VPG did not show uniform vesicles, but rather micellar and vesicular structures occurring simultaneously. Viscosity characterization using rotational viscometer revealed differences between the carrier systems with and without MB for DSPC and DSPC:TEL (50:50) formulations, which could already been suspected from the SEM images. In contrast to that DSPC:TEL (80:20) and DSPC:TEL (70:30) VPGs showed nearly the same rheological behavior. During the rheological investigation of the hydrogels obtained from PC-C32-PC and Me2PE-C32-Me2PE the stability of the self-organized hydrogels decreased with minimal shear forces. This fact indicates an inadequate stability at the application site using these hydrogels. With the help of sublimation in a conventional freeze-drier it was possible to create stable aerogels which could be transformed into hydrogels in situ by addition of water. The fully hydrated aerogels showed only slightly different behavior in the rheogram compared to original hydrogels. Morphological characterization of the aerogels was realized using SEM. Both aerogels showed uniform pores within the carrier system. This is comparable to freeze-dried hydrogels, which are already used as intelligent wound dressings in the therapy of deep wounds. Chapter 4 investigated the drug release behavior of the drug delivery systems. All of the gels tested were able to release MB: The vesicular phospholipid gels were able to release MB in a sustained manner over several days. In particular, the VPGs made from DSPC:TEL (80:20) and DSPC:TEL (70:30) with a release time of seven days are very interesting candidates for long-term therapy of chronic wound infections. In contrast the release of PC-C32-PC and Me2PE-C32-Me2PE aerogels took only six and eight hours, respectively, due to the burst-release of the active ingredient at the beginning and the delayed gel formation. This fact hampers the use of native aerogels as intelligent drug delivery systems for long-term therapy. In contrast, the hydrated aerogels (hydrogels) show a clearly delayed release, which was superior to HEC 300 hydrogels used as reference. Combining the advantages of both systems appears to be more effective. Aerogels have long-term stability and are an easy-to-use system for in situ hydrogel formation. The investigation of the photodynamic effect of the drug carrier systems on the gram-positive germs Staphylococcus saprophyticus subsp. bovis (DSM 18669) and Staphylococcus aureus subsp. aureus (ATCC 25923) and the gram-negative bacteria Escherichia coli (DH5α) was discussed in Chapter 5. To the gram-positive germ a bacteriostatic effect under the MB-mediated treatment with the carrier systems even without exposure to radiation could be observed due to the bacteriostatic effect of the MB itself. After irradiation an increased bacteriostatic effect was found for both germs. The bactericidal effect occurred under the aPDT in both germs but could only be quantified in S. saprophyticus subsp. bovis (DSM 18669), as the measurement data from the Šumperk Hospital in the Czech Republic, where the experiments were carried out, was not available. E. coli (DH5α) showed no sensitivity to the active substance carrier systems loaded with MB without applied aPDT. After irradiation both bacteriostatic and bactericidal effect took place. However, the effect was less distinctive compared to gram-positive bacteria. Chapter 6 dealt with the characterization of the aPDT sensitivity of yeasts under therapy with the carrier systems made from natural and synthetic bolaamphiphiles. Saccharomyces cerevisiae was chosen as model germ. Similar to the gram-positive cocci, the microorganisms exhibited a slight fungistatic and occasional fungicidal effect even without irradiation. Using aPDT, both effects were considerably increased in all drug delivery systems. Additionally, with exception of the PC-C32-PC aerogel, all systems were superior compared to the control group. Mucous membranes and the wound bed represent application sites which have special requirements on the drug delivery systems. For this reason, Chapter 7 examined the compatibility of gels made from DSPC and DSPC:TEL with blood components. All VPGs with and without MB were tested for their hemolytic potential. Drug delivery systems containing DSPC and DSPC:TEL (80:20) showed no hemolytic value. Based on the use of higher amount of GLE with included impurities VPGs made by DSPC:TEL (70:30) and DSPC:TEL 850:50) demonstrated moderate hemolytic potential. In summary, it was found that only the DSPC- and DSPC:TEL (80:20)-system fulfill all requirements of good tolerability with blood components. Due to the small sample volume, this experiment could not be carried out with the aerogels made by PC-C32-PC and Me2PE-C32-Me2PE. Long-term biocompatibility of the aerogels, the mucosal tolerance and the tolerance of the applied aPDT of all drug delivery systems made from bolaamphiphils were finally evaluated in Chapter 8 using the chorioallantoic membrane (CAM). The mucosal compatibility of the gels of DSPC, DSPC: TEL, PC-C32-PC and Me2PE-C32-Me2PE was compared with a hydroxyethyl cellulose 300 (HEC 300) hydrogel, suitable for vaginal application, using the “henn´s egg test on the chorioallantoic membrane“ (HET-CAM. Biocompatibility of the bolaamphiphilic drug delivery systems matched that of the HEC 300 hydrogel. In order to investigate the long-term biocompatibility of the PC-C32-PC and Me2PE-C32-Me2PE aerogels daily observations starting on egg development day 9 (EDD 9) of the blood vessels on CAM surface were conducted till EDD 14. A different hydration behavior of both aerogels was noticed which, however, did not affect the tolerability. Both systems were inert to the growing blood vessel system and no defense reactions were visible. Side effects of PDT can include eradication of the microorganisms on the skin, mucous membrane or in the wound bed, as well as damage to healthy tissue. An examination of the biocompatibility of the therapy on the CAM was therefore carried out in Chapter 8 also. In order to ensure that neither the acting radiation nor the drug delivery system without active ingredient influenced the integrity of the blood vessels, these parameters were excluded in advance. The LED-mediated aPDT with MB using the DSPC and DSPC: TEL VPGs as well as the PC-C32-PC and Me2PE-C32-Me2PE aerogels took place in comparison to aqueous MB solution of the same concentration. Compared to the MB solution, the damage after irradiation is significantly less for all drug delivery systems. In particular, 24 and 48 hours after the treatment, there are serious differences in terms of vascular integrity within the CAM. While the considerable damage during the treatment with the reference system caused a structural change in the CAM, which manifested itself in a whitish-necrotic appearance, no such changes could be observed for the aPDT with all the bolaamphiphile-drug delivery systems. This fact proves the superior compatibility of the gels compared to the reference solution of the same active substance concentration. In conclusion it can therefore be noted that stable formulations have been successfully developed from both natural and synthetic bolaamphiphiles. They are suitable for antimicrobial photodynamic therapy and at the same time are well tolerated. These characteristics qualify them as potential delivery systems for clinical application on skin, mucous membrane and wound infections.
In der vorliegenden Arbeit wurden neuartige Wirkstoffträgersysteme auf der Basis von natürlich vorkommenden und synthetischen Bolaamphiphilen für die antimikrobielle photodynamische Therapie (aPDT) gegenüber Bakterien und Hefen generiert, charakterisiert und erste in vitro Versuche durchgeführt. Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung von stabilen Trägersystemen aus beiden Bolaamphiphilen, welche sowohl eine adäquate Therapie ermöglichen, als auch haut- und schleimhautverträglich sind. Dabei wurden beide Systeme gegenübergestellt. In Kapitel 1 erfolgte eine Einleitung an dem dieser Arbeit zugrundeliegenden Thema mit einer Erläuterung der Problematik von wachsender Antibiotikaresistenz bei chronischen Wunden und durch Hefen verursachten Schleimhautinfektionen, mit gleichzeitig fehlendem adäquatem Therapie- und Wundmanagement. Die Photodynamische Therapie (PDT) als möglicher Lösungsansatz wurde vorgestellt und der Vorteil der Anwendung von Wirkstoffträgersystemen aus Bolaamphiphilen hervorgehoben. Dem ersten Kapitel nachfolgend fand die Zusammenfassung und Erläuterung der in dieser Arbeit verwendeten Herstellungs- und Charakterisierungsmethoden in Kapitel 2 statt. In Kapitel 3 sind die Herstellung und Charakterisierung beider Wirkstoff-trägersysteme dargestellt. Zunächst konnten die natürlichen bolaamphiphilen Lipide (Tetraetherlipide – TEL) erfolgreich aus der Biomasse von Sulfolobus acidocaldarius extrahiert und unter Zuhilfenahme des Phospholipids 1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phospatidylcholin (DSPC) in verschiedenen Massenanteilen stabile vesikuläre Phospholipid Gele (VPGs) entwickelt werden. Die Charakterisierung selbiger fand mittels Rasterelektronenmikroskopie (REM), cryo-Transmissionselektronen-mikroskopie (cryo-TEM) und Rotationsviskosimetrie statt. In den REM Aufnahmen war festzustellen, dass sich die Trägersysteme teilweise mit und ohne eingearbeiteten Wirkstoff voneinander unterschieden. Die aufgestellte Hypothese, dass bei dem mit DSPC:TEL (50:50) hergestellten VPG ohne Methylenblau (MB) eine Phasenseparation des Systems vorlag, wurde bei den daran anknüpfenden cryo-TEM Untersuchungen bestätigten. Die bei der Messung auf 2 mg/mL verdünnten VPGs zeigten wie erwartet die sich spontan im wässrigen Medium bildenden Strukturen von Phospholipiden und TEL. Zu beobachten war eine Zunahme der Vesikelgröße mit wachsenden Anteilen zugesetzten TEL. Im Gegensatz dazu zeigte das DSPC:TEL (50:50)-System keine einheitlichen Vesikel, sondern gleichzeitig auftretende mizellare und vesikuläre Strukturen. Die Charakterisierung des Fließverhaltens mittels Rotationsviskosimeter offenbarte Unterschiede zwischen den aus DSPC und DSPC:TEL (50:50) hergestellten Trägersystemen mit und ohne MB, welche sich bereits in den REM Aufnahmen andeuteten, im Gegensatz zu den VPGs aus DSPC:TEL (80:20) und DSPC:TEL (70:30). Bei der rheologischen Untersuchung der aus PC-C32-PC und Me2PE-C32-Me2PE gewonnenen Hydrogele konnte festgestellt werden, dass die Stabilität der selbstorganisierten Hydrogele bei minimalen Scherkräften abnahm, so dass ein Verbleib der Trägersysteme am späteren Applikationsort mit ausreichend hoher Belastbarkeit nicht sicher angenommen werden konnte. Im Anschluss an eine stattfindende Sublimation der inneren Phase in einem herkömmlichen Gefriertrockner wurden stabile Aerogele erzeugt, die sich durch Zugabe von Flüssigkeit in situ zu Hydrogelen rückwandelten. Die vollständig hydrierten Aerogele zeigten im Rheogramm ein nur geringfügig anderes Verhalten als vor der Aerogel-Bildung. Eine morphologische Charakterisierung der Aerogele fand wie bei den VPGs ebenfalls mittels REM statt. Sowohl das aus PC-C32-PC hergestellte Aerogel als auch das Pendant mit Me2PE-C32-Me2PE zeigten dabei eine gleichmäßige Porung innerhalb des Trägersystems, welche mit denen von gefriergetrockneten Hydrogelen vergleichbar ist, die bereits als intelligente Wundauflagen in der Therapie von tiefen Wunden eingesetzt werden. In Kapitel 4 sind die pharmakologischen Aspekte der Wirkstoffträgersysteme dargestellt. Alle getesteten Gele konnten den eingeschlossenen Wirkstoff aus dem System entlassen: Die VPGs aus DSPC und DSPC:TEL waren in der Lage MB retardiert über mehrere Tage freizusetzen. Insbesondere die aus DSPC:TEL (80:20) und DSPC:TEL (70:30) hergestellten Systeme mit einer Freisetzungsdauer von 7 Tagen sind sehr interessante Kandidaten für eine Langzeittherapie von chronischen Wundinfektionen. Anders die Aerogele aus PC-C32-PC und Me2PE-C32-Me2PE deren Freisetzung aufgrund der hohen Austrittsgeschwindigkeit des Wirkstoffes zu Beginn und der erst später eintretenden, retardiert wirkenden Gelbildung lediglich sechs bzw. acht Stunden benötigten. Dieser Umstand erschwert den Einsatz der nativen Aerogele als intelligente Wirkstoffträgersysteme für eine Langzeittherapie. Im Gegensatz dazu zeigen die hydrierten Aerogele (Hydrogele) eine deutlich kontrollierte Freisetzung, die hinsichtlich der Freisetzungsdauer den als Referenz herangezogenen Hydroxyethylcellulose 300 (HEC 300) Hydrogelen überlegen war. Die Vorteile beider Systeme zu kombinieren, scheint effektiver zu sein. Aerogele besitzen eine Langzeitstabilität und sind ein einfach zu handhabendes System zur in situ Hydrogelbildung. Die Untersuchung der photodynamischen Wirkung der Wirkstoffträgersysteme auf den grampositiven Keimen Staphylococcus saprophyticus subsp. bovis (DSM 18669) und Staphylococcus aureus subsp. aureus (ATCC 25923) sowie auf das gramnegative Bakterium Escherichia coli (DH5α) fanden in Kapitel 5 statt. Auf die grampositiven Bakterien zeigte sich auch ohne einwirkende Bestrahlung ein bakteriostatischer Effekt unter der MB-vermittelten Behandlung mit den Trägersystemen, was auf den bakteriostatischen Effekt des MB selbst zurückzuführen war. Bei Bestrahlung konnte eine gesteigerte bakteriostatische Wirkung bei beiden Keimen festgestellt werden. Die bakterizide Wirkung trat unter der aPDT bei beiden Keimen auf, konnte jedoch lediglich bei S. saprophyticus subsp. bovis (DSM 18669) quantitativ bestimmt werden, da die Messdaten aus dem Šumperk Krankenhaus der Tschechischen Republik, wo die Versuche stattfanden, nicht vorlagen. E. coli (DH5α) zeigte keine Sensitivität gegenüber den mit MB beladenen Wirkstoffträgersystemen ohne angewandte aPDT. Erst mit der Bestrahlung fanden sowohl eine bakteriostatische als auch eine bakterizide Wirkung statt, die jedoch in ihrer Ausprägung geringer ausfiel als bei den grampositiven Bakterien. Kapitel 6 befasste sich mit der Charakterisierung der aPDT Sensitivität von Hefen unter einer Therapie mit den hergestellten Trägersystemen aus natürlichen und synthetischen Bolaamphiphilen. Als Modellkeim diente dabei Saccharomyces cerevisiae. Analog zu den grampositiven Kokken, war bei den Mikroorganismen auch ohne Bestrahlung eine geringe fungistatische und vereinzelnd fungizide Wirkung vorhanden. Unter der aPDT verstärkten sich beide Effekte deutlich bei allen Wirkstoffträgersystemen, die bis auf das PC-C32-PC Aerogel der Kontrollgruppe überlegen waren. Sowohl Schleimhäute als auch das Wundbett sind Applikationsorte, die besondere Ansprüche an das Trägersystem stellen. Daher fand in Kapitel 7 die Untersuchung der Verträglichkeit von aus DSPC und DSPC:TEL hergestellten Gele gegenüber Blutbestandteilen statt. Die VPGs wurden sowohl mit als auch ohne Wirkstoff auf ihr hämolytisches Potential getestet. Sowohl die Trägersysteme aus DSPC als auch die mittels DSPC:TEL (80:20) hergestellten, zeigten mit und ohne MB gute Verträglichkeit gegenüber Erythrozyten. Die mittels DSPC:TEL (70:30) und DSPC:TEL (50:50) hergestellten Systeme wiesen einen mäßig hohen hämolytischen Wert auf, der in den Verunreinigungen des verwendeten GLE begründet liegt. Zusammenfassend ließ sich daher feststellen, dass lediglich die DSPC- und DSPC:TEL (80:20)-haltigen Wirkstoffträgersysteme für die MB-vermittelte aPDT vollumfänglich geeignet sind. Dieser Versuch konnte aufgrund des geringen Probenvolumens nicht mit den Aerogelen aus PC-C32-PC und Me2PE-C32-Me2PE durchgeführt werden. Die Langzeitverträglichkeit der Aerogele, die Kompatibilität mit Schleimhäuten sowie die Toleranz von selbigen gegenüber der angewandten aPDT aller bolaamphiphil-haltigen Wirkstoffträgersysteme wurde abschließend in Kapitel 8 unter Zuhilfenahme der Chorioallantois-Membran (CAM) evaluiert. Zunächst konnte mittels des „henn´s egg test on the chorioallantoic membrane“ (HET-CAM) die Schleimhaut-verträglichkeit der aus DSPC, DSPC:TEL, PC-C32-PC und Me2PE-C32-Me2PE hergestellten Gele vergleichend mit einem für die vaginale Applikation geeigneten Hydrogel aus HEC 300 verglichen werden. Dabei war die Verträglichkeit der neuartigen Wirkstoffträgersysteme aus Bolaamphiphilen mit jenem aus HEC 300 vergleichbar. Um die Langzeitverträglichkeit der aus synthetischen Bolaamphiphilen generierten Aerogele am späteren Applikationsort zu untersuchen, fand beginnend mit Tag 9 der embryonalen Entwicklung eine tägliche Beobachtung des Wachstumsverhaltens der Blutgefäße und das Auftreten von Blutungen, Gefäßlyse oder Koagulation in unmittelbarer Umgebung des Aerogels bis einschließlich Tag 14 sowohl makroskopisch als auch mikroskopisch statt. Dabei trat ein unterschiedliches Hydratationsverhalten beider Aerogele in Erscheinung, welches sich jedoch nicht auf die Verträglichkeit auswirkte. Beide Systeme waren gegenüber dem wachsenden Blutgefäßsystem inert und es waren keine Abwehrreaktionen sichtbar. Nebenwirkungen der aPDT können neben der Eradikation der auf der Haut, Schleimhaut oder im Wundbett befindlichen Mikroorganismen auch Schädigungen an gesundem Gewebe sein. Daher fand eine Untersuchung der Biokompatibilität der Therapie auf der CAM ebenfalls in Kapitel 8 statt. Um sicherzustellen, dass weder die einwirkende Strahlung noch die Trägersysteme ohne Wirkstoff Einfluss auf die Integrität der Blutgefäße nahmen, wurden diese Parameter vorab ausgeschlossen. Die LED-vermittelte aPDT mit MB unter Anwendung der DSPC- und DSPC:TEL-haltigen VPGs sowie der PC-C32-PC- und Me2PE-C32-Me2PE-haltigen Aerogele fand vergleichend mit wässriger MB-Lösung gleicher Konzentration statt. Verglichen mit der MB-Lösung war der Schaden nach der Bestrahlung bei allen Wirkstoffträgersystemen deutlich geringer. Insbesondere 24 bzw. 48 Stunden nach der Behandlung fanden sich gravierende Unterschiede bezüglich der Gefäßintegrität innerhalb der CAM. Während bei der Referenz die erheblichen Schäden während der Behandlung für eine strukturelle Veränderung der CAM sorgte, die sich in weißlich-nekrotischem Erscheinungsbild äußerte, blieben dieses bei der aPDT mit allen neuartig entwickelten Wirkstoffträgersystemen aus Bolaamphiphilen aus. Dieser Umstand belegt die im Vergleich zur Referenzlösung gleicher Wirkstoffkonzentration überlegene Verträglichkeit der Gele. Zusammenfassend ist es daher festzustellen, dass es gelungen ist stabile Formulierungen aus sowohl natürlichen als auch synthetischen Bolaamphiphilen zu entwickeln, die für die antimikrobielle photodynamische Therapie geeignet sind und gleichzeitig eine gute Verträglichkeit aufweisen. Dieser Umstand qualifiziert sie als potentiell gute Kandidaten für die klinische Anwendung für Haut-, Schleimhaut und Wundinfektionen.
Databáze: OpenAIRE
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