Molekulare und physiologische Funktion von IRAG2 in Thrombozyten und im Pankreas

Autor: Prüschenk, Sally
Rok vydání: 2023
Předmět:
DOI: 10.5283/epub.53579
Popis: Das Inositol-1,4,5-trisphosphat Rezeptor assoziierte 2 (IRAG2) wird auch als Jaw1 oder lymphoid restricted membrane protein (LRMP) bezeichnet und ist über seine C-terminale Transmembrandomäne am endoplasmatischen Retikulum (ER) verankert. Exprimiert wird IRAG2 vor allem in lymphatischen Geweben und Zellen, wie Thymus, Milz, B-Zelllinien oder T-Zelllinien, aber auch in nicht lymphatischen Organen und Zellen, wie Sinusknoten, Geschmacksknospen vom Typ süß, bitter und umami oder in Bürstenzellen des Darms. Im Rahmen dieser Arbeit wird nun auch eine Expression von IRAG2 in Thrombozyten sowie im Pankreas gezeigt. Die coiled-coil-Domäne von IRAG2 zeigt eine ausgeprägte Homologie zu der des Inositol-1,4,5-trisphosphat Rezeptor assoziierten cGMP Kinase Substrats 1 (IRAG1). Diese Domäne ist für die Interaktion von IRAG1 mit den IP₃-Rezeptoren (IP₃R) entscheidend. Eine Interaktion von IRAG2 mit dem IP₃R3 ist bereits in transfizierten COS7-Zellen beschrieben, außerdem ist eine Interaktion mit dem IP₃R2 in intestinalen Bürstenzellen gezeigt. Auch in Thrombozyten und im Pankreas kann nun in der vorliegenden Arbeit eine Interaktion von IRAG2 mit den IP₃-Rezeptor Subtypen 1, 2 und 3 nachgewiesen werden. Erstmals kann damit auch die Interaktion mit dem IP₃R1 bewiesen werden. IRAG1 bildet zusammen mit der PKGIβ sowie dem IP₃R1 einen trimären Komplex. Nach Phosphorylierung durch die PKGIβ hemmt IRAG1 die Ca²⁺-Freisetzung aus dem ER und somit auch die Thrombozytenaggregation. In der vorliegenden Arbeit wurden die Interaktionspartner von IRAG2 in Thrombozyten untersucht. Eine stabile Interaktion von IRAG2 und der PKGIβ wird dabei nicht nachgewiesen. Allerdings kann gezeigt werden, dass IRAG2 in Thrombozyten nach Stimulation durch cGMP-Analoga phosphoryliert wird. Da IRAG2 in Thrombozyten mit den IP₃-Rezeptor Subtypen 1, 2 und 3 interagiert, wurde der Einfluss von IRAG2 auf die Ca²⁺-Freisetzung sowie die Thrombozytenaggregation untersucht. Zudem wurde die NO/cGMP-abhängige Hemmung der Thrombozytenaggregation betrachtet. Dabei zeigt sich in IRAG2-KO Thrombozyten eine signifikant verringerte Ca²⁺-Freisetzung, verglichen mit dem IRAG2-WT, was sich auch auf die Aggregabilität der Thrombozyten auswirkt. Die Thrombozyten von IRAG2-KO Tieren weisen eine verringerte Aggregationsrate auf, verglichen mit dem IRAG2-WT. Bei Stimulation mit dem cGMP-Analogon 8-pCPT-cGMP sowie dem NO-Donor SNP ist die Aggregationshemmung in den Thrombozyten der IRAG2-KO Tiere sogar noch stärker ausgeprägt als in denen der IRAG2-WT Tiere. Alle diese Daten deuten darauf hin, dass IRAG2, nach Aktivierung des NO/cGMP/PKG-Signalweges, durch die PKGI phosphoryliert wird und somit die Ca²⁺-Freisetzung aus dem ER fördert. Dies wiederum resultiert in einer verstärkten Thrombozytenaggregation. Aus diesem Grund kann IRAG2 möglichweise als der Gegenspieler zu IRAG1 in Thrombozyten angesehen werden. IRAG2 wird im Rahmen dieser Arbeit im exokrinen Pankreas im apikalen Bereich der Azinus-Zellen lokalisiert. Diese Zelltypen sind für die Sekretion von Verdauungsenzymen von Bedeutung. Im Pankreas interagiert IRAG2 mit den IP₃-Rezeptor Subtypen 1, 2 und 3, die ebenso vor allem im apikalen Teil der Azinus-Zellen exprimiert werden. In der vorliegenden Arbeit kann im IRAG2-KO eine Verringerung der Expression des IP₃R2 sowie eine Erhöhung der IP₃R3 Expression nachgewiesen werden. Die basale Ca²⁺-Freisetzung ist dabei im IRAG2-KO signifikant verringert, verglichen mit dem IRAG2-WT. Dies resultiert auch in einer verringerten basalen Amylase-Sekretion. Durch die verminderte basale Amylase-Sekretion im IRAG2-KO bleibt mehr Amylase in den zymogenen Granula der Azinus-Zellen zurück. Dies scheint jedoch weder einen signifikanten Einfluss auf die Menge der Granula noch auf die Morphologie der Azini zu haben. Die IRAG2-KO Tiere entwickeln sich auch hinsichtlich ihrer Körpergewichte annähernd normal, was letztlich zu der Annahme führt, dass es durch die verminderte basale Amylase-Sekretion zu keiner signifikanten Beeinträchtigung der Verdauung von Nahrungsbestandteilen kommt und die verringerte Amylase-Sekretion somit ausgeglichen werden kann. IRAG2 fördert damit die basale Ca²⁺ Freisetzung, möglicherweise durch eine Aktivierung der IP₃-Rezeptoren. Bei Stimulation mit Carbachol hingegen wird in den IRAG2-KO Azinus-Zellen – normalisiert auf die basale Ca²⁺-Menge – mehr Ca²⁺ freigesetzt als im IRAG2-WT. Dies könnte auf einen Kompensationsmechanismus in den IRAG2-KO Azinus-Zellen zurückzuführen sein, durch den die verringerte basale Ca²⁺-Menge ausgeglichen werden soll. Auch die Frequenz von Ca²⁺-Oszillationen ist im IRAG2-KO höher als im IRAG2-WT. Die Ursache hierfür könnte eine Modulation der IP₃-Rezeptoren durch IRAG2 sein oder aber auch ein kompensatorischer Mechanismus zum Ausgleich der verminderten basalen Ca²⁺-Freisetzung.
Inositol-1,4,5-trisphosphate receptor associated 2 (IRAG2) is also known as Jaw1 or lymphoid restricted membrane protein (LRMP) and is anchored to the endoplasmic reticulum (ER) via its C-terminal transmembrane domain. IRAG2 is expressed mainly in lymphoid tissues and cells, such as thymus, spleen, B-cell or T-cell lines, but also in non-lymphoid tissues and cells, such as sinoatrial nodes, sweet, bitter and umami taste-responsive cells or intestinal tuft cells. In this work, expression of IRAG2 is shown in platelets as well as in the pancreas. IRAG2 shows a homology to inositol-1,4,5-trisphosphate receptor associated cGMP kinase substrate 1 (IRAG1), especially in its coiled-coil domain. This domain is essential for the interaction of IRAG1 with IP₃-receptors (IP₃R). Interaction of IRAG2 with IP₃R3 was previously described in COS7 heterologous expression system. Also, interaction with IP₃R2 was shown in intestinal tuft cells. In the present work it can be demonstrated, that IRAG2 interacts with the IP₃-receptor subtypes 1, 2 and 3 in platelets and in the pancreas. Thus, an interaction of IRAG2 with IP₃R1 can be demonstrated for the first time. IRAG1 forms a macro complex consisting of IRAG1, PKGIβ and IP₃R1. After phosphorylation by PKGIβ, IRAG1 inhibits Ca²⁺-release from the ER and consequently inhibits platelet aggregation. In the present work, interaction partners of IRAG2 were investigated in platelets. A stable interaction of IRAG2 and PKGIβ is not detected. However, it can be shown that IRAG2 is phosphorylated in platelets upon stimulation with cGMP-analogues. As IRAG2 interacts with the IP₃-receptor subtypes 1, 2, and 3 in platelets, the effect of IRAG2 on Ca²⁺-release and platelet aggregation was investigated. In addition, NO/cGMP-dependent inhibition of platelet aggregation was examined. Thereby, IRAG2-KO platelets show a significantly decreased Ca²⁺-release compared with platelets of IRAG2-WT, which also affects platelet aggregability. Platelets from IRAG2-KO animals exhibit a decreased aggregation rate, compared to platelets from IRAG2-WT. Upon stimulation with the cGMP-analogue 8-pCPT-cGMP or the NO donor SNP, inhibition of platelet aggregation is even more pronounced in platelets from IRAG2-KO than in those from IRAG2-WT animals. These data suggest that IRAG2 is phosphorylated by PKGI and thus promotes Ca²⁺-release from the ER upon activation of the NO/cGMP/PKG pathway, resulting in an increased platelet aggregation. Therefore, IRAG2 may be considered as a counterpart of IRAG1 in murine platelets. In this work, IRAG2 is localized in the exocrine pancreas in the apical region of the acinar cells. These pancreatic acini are important for secretion of digestive enzymes. In the pancreas, IRAG2 interacts with IP₃-receptor subtypes 1, 2, and 3, which are also expressed primarily in the apical portion of the acinar cells. In the present work, a decrease in IP₃R2 expression and an increase in IP₃R3 expression can be detected in the pancreas of IRAG2-KO animals. Thereby, basal Ca²⁺-release is significantly decreased in IRAG2-KO compared to IRAG2-WT. This also results in a decreased basal secretion of amylase. The decreased basal amylase-secretion in IRAG2-KO animals leads to a higher amount of amylase that remains in the zymogenic granules of the acinar cells. However, this does not appear to have a significant effect on either the amount of granules or the morphology of the acini. The IRAG2-KO animals also develop normally with respect to their body weights, which leads to the assumption that there is no significant impairment of nutrient digestion due to the reduced basal amylase-secretion. Hence, IRAG2 promotes basal Ca²⁺-release, possibly by activating IP₃-receptors. In contrast, when stimulated with carbachol, more Ca²⁺ is released in IRAG2-KO acinar cells – normalized to basal Ca²⁺ levels – than in IRAG2-WT cells. This might be a compensatory mechanism in IRAG2-KO acinar cells to offset decreased basal Ca²⁺-amount. The frequency of Ca²⁺-oscillations is also higher in Acini of IRAG2-KO than in those of IRAG2-WT animals. This might be caused due to modulation of IP₃-receptors by IRAG2 or could also be a compensatory mechanism to offset decreased basal Ca²⁺-release.
Databáze: OpenAIRE
Externí odkaz: