In vitro und in vivo Charakterisierung der putativen mitochondrialen Nuklease MNU2 in Arabidopsis thaliana

Autor: Mayer, Kevin Christopher
Přispěvatelé: Binder, Stefan, Schäfer, Patrick
Jazyk: němčina
Rok vydání: 2023
Předmět:
DOI: 10.18725/oparu-47816
Popis: Diese Arbeit beschäftigte sich mit der Charakterisierung der putativen mitochondrialen Nuklease 2 MNU2 durch in vivo und in vitro Analysen. MNU2 besitzt neben zwei potentiellen RNA-bindenden Lotus-Domänen und einer putativen NYN-Nuklease-Domäne zwei weitere Domänen, die WW- und OHA-Domäne genannt werden. Da ein Knockout von MNU2 das Transkriptlevel und -muster der ccmFN2-, nad3-rps12 und nad9-Transkripte beeinflusst, wurde davon ausgegangen, dass MNU2 die Funktion einer Nuklease in Bezug auf die 5´-Prozessierung mitochondrialer Transkripte übernehmen könnte. Northern-Blot-Analysen der nad3-rps12-mRNA Prozessierung von MNU2-Mutanten mit Veränderungen einzelner Bereiche in den Domänen deuteten darauf hin, dass eine Deletion der WW- beziehungsweise OHA-Domäne von MNU2 nicht mit dessen Funktion interferierte. Dagegen führte die Deletion größerer Teile des Proteins mit mehreren Domänen stets zu einer Inaktivierung von MNU2. Während die Mutation konservierter Aminosäuren innerhalb der Lotus2-Domäne keinen Einfluss auf die Prozessierung der nad3-rps12-mRNA hatte, führte die Mutation der Lotus1-Domäne zur Aufhebung der MNU2-Funktion. Ein Austausch konservierter Aspartat- und Glutamat-Reste innerhalb der NYN-Domäne führten dagegen nur in einem Teil der untersuchten Pflanzen zu einer Inaktivierung von MNU2. In vitro Analysen eines Fusionsproteins aus der Arabidopsis RNaseP PRORP1 und der NYN-Domäne aus MNU2 konnten keine Nukleaseaktivität in Bezug auf ein Minimalsubstrat von PRORP1 aufdecken. Die Untersuchung von rekombinanten, partiell aufgereinigten MNU2 selbst deutete auf eine endonukleolytische Prozessierung eines ssRNA-Substrats hin. Dagegen konnte diese Prozessierung nicht für dsRNA oder ein ssRNA-Substrat mit abweichender Fluoreszenzmarkierung beobachtet werden. Auch RNA-Substrate mit interner Sekundärstruktur zeigten keine Prozessierung durch MNU2. Zusätzlich konnte die Untersuchung potentieller Protein-Protein-Interaktionen auf eine schwache Interaktion zwischen MNU1 und PRORP1, sowie MNU2 und PRORP1 hinweisen, nicht aber auf eine Interaktion zwischen MNU1 und MNU2. In einer weiteren Analyse der subzellulären Lokalisation der beiden putativen mitochondrialen Nukleasen MNU3, MNU5 und MNU6 gelang der Nachweis einer mitochondrialen Lokalisation von MNU3 und MNU6, nicht aber für MNU5. Auch der Versuch zur Etablierung einer Vierfachmutante durch den Knockout der Gene MNU3 und MNU6 mit Hilfe des CRISPR-Cas9-Systems in der Doppelknockoutmutante mnu1-2/mnu2-1 blieb ohne Erfolg.
The main focus of this thesis was the characterisation of the putative mitochondrial nuclease MNU2 by in vivo and in vitro experiments. MNU2 contains two potential RNA-binding Lotus-domains as well a NYN-domain with a putative nuclease function. As a knockout of MNU2 affects the transcript level and pattern of ccmFN2, nad3-rps12 and nad9, MNU2 was thought to act as a nuclease regarding 5´-processing of mitochondrial transcripts. The Northern blot analyses of total RNA from different MNU2 mutants indicated that a deletion of the WW- or OHA-domain does not interfere with protein function. In contrast, the deletion of different domain combinations always inactivated MNU2. While the mutation of conserved amino acids in the Lotus2-domain had no influence on the processing of the nad3-rps12-transcript, the mutation of analogue amino acids in the Lotus1-domain abolished the function of MNU2. However, the mutation of conserved aspartate- and glutamate-residues in the NYN-domain caused an inactivation of MNU2 only in some of the investigated plants. In vitro analyses of a fusion protein consisting of the Arabidopsis RNaseP PRORP1 and the NYN-domain of MNU2 could not detect a nuclease activity for the PRORP1 minimal substrate. Processing assays with recombinant, partially purified MNU2 indicate an endonucleolytic cut within a ssRNA substrate, whereas no processing of a dsRNA or another ssRNA with a different fluorescent labelling could be observed. Also, MNU2 did not process RNA substrates with an internal secondary structure. Additionally, the investigation of potential protein-protein interactions suggested a weak interaction between MNU1 and PRORP1 as well as between MNU2 and PRORP1. An interaction between MNU1 and MNU2 could not be detected. In an additional analysis of the subcellular localisation of the putative mitochondrial nucleases MNU3, MNU5 and MNU6, a mitochondrial localisation was found for MNU3 and MNU6, but not MNU5. Furthermore, the attempt to establish a quadruple mutant by a knockout of MNU3 and MNU6 in the double knockout mutant mnu1-2/mnu2-1 using the CRISPR-Cas9 system was not successful.
Databáze: OpenAIRE
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