| Popis: |
Белки теплового шока GroEL и GroES представляют собой одну из наиболее важных групп молекулярных шаперонов, необходимых для правильного сворачивания и рефолдинга многих клеточных белков [1]. Известно, что в условиях стресса количество GroEL в клетках бактерий, в частности Escherichia coli, резко увеличивается [2], а нарушение экспрессии гена groEL приводит к гибели клеток [3]. Аэробные метилотрофные бактерии, использующие токсичные С1-соединения (метанол, формальдегид, галометаны и др.) в качестве единственных источников углерода и энергии, широко распространены в окружающей среде. Однако, несмотря на то, что они используют токсичные субстраты и зачастую обитают в средах с экстремальными условиями (на поверхности растений, в почвах, водах), эта группа бактерий на удивление плохо изучена с точки зрения функций основных клеточных шаперонов. Целью нашего исследования было изучение роли множественных гомологов шаперонинов GroEL у факультативных метилотрофных бактерий Methylobacterium oryzae CBMB20Т и Methylobacterium brachiatum B0021Т, выделенных из разных экологических ниш. CBMB20Т – известный симбионт риса, B0021Т – метилотроф, изолированный из сточных вод предприятия пищевой промышленности. В результате анализа генома M. oryzae CBMB20Т нами выявлено два паралога гена groEL (MOC_0690 и MOC_4715), генома M. brachiatum B0021Т – три паралога (LRG69_02710, LRG69_29215 и LRG69_29625), характеризующихся различным уровнем сходства кодируемых белков GroEL между собой (44–91%). За исключением groEL3 (LRG69_29625) M. brachiatum B0021Т, все паралоги гена groEL входили в состав бицистронных оперонов groESL1 и groESL2. На первом этапе исследований нами были изучены промоторные регионы данных оперонов. Для этого предполагаемые промоторные последовательности (277–671 п.н.) были клонированы в ранее сконструированную нами беспромоторную плазмиду pCMgfp [4], несущую ген зеленого флуоресцирующего белка gfp из вектора pGreenTIR. Во всех случаях клонированная последовательность полностью включала участок между стартовым кодоном гена groES и соседним вышерасположенным геном с захватом небольших частей этих генов. Полученные репортерные плазмиды, несущие gfp под контролем предполагаемых нативных промоторов оперонов groESL, были перенесены в штаммы M. oryzae и M. brachiatum методом двуродительского скрещивания с использованием в качестве донора E. coli S17-1. Измерение флуоресценции в клетках репортерных штаммов проведено на флуориметре FLUOstar OPTIMA (“BMG Labtech”, Германия), при длинах волн: возбуждения – 485 нм, эмиссии – 510 нм. Флуоресценция gfp была детектирована в клетках 4 изученных репортерных штаммов, выращенных на метаноле (рис. 1). В случае M. brachiatum промоторные последовательности оперонов groESL1 и groESL2 (PgroESL1 и PgroESL2, соответственно) обеспечивали близкие уровни флуоресценции gfp. Это указывает на то, что у M. brachiatum оба оперона groESL в равной степени активны и, возможно, взаимозаменяемы. Напротив, у M. oryzae PgroESL1 обусловил в 9,6 раза более высокий уровень флуоресценции по сравнению с PgroESL2. Следовательно, у M. oryzae оперон groESL1 существенно более активен, чем groESL2. Подобное наблюдается у метилотрофа Methylorubrum extorquens DM4, когда «housekeeping» оперон groESL1 активно экспрессируется и необходим для жизнеспособности клеток, тогда как вторая пара генов groESL2 с низким уровнем экспрессии участвует в адаптации бактерий к некоторым стрессам (кислотному, солевому), обусловленным использованием токсичного субстрата – дихлорметана [4]. Транслированная аминокислотная последовательность GroEL3 M. brachiatum B0021Т характеризуется низким уровнем сходства с другими шаперонинами GroEL данного штамма (44%). Кодирующий ее ген groEL3 находится, предположительно, в составе несвойственного для метилобактерий кластера генов метанмонооксигеназы (MMO), катализирующей окисление метана у метанотрофов. Измерен уровень флуоресценции gfp под контролем промоторной последовательности Pmmo (618 п.н.), расположенной выше стартового кодона первого гена предполагаемого mmo-оперона, в клетках, выращенных на метаноле в присутствии метана. Активность Pmmo оказалась на порядок более низкой по сравнению с PgroESL1 и PgroESL2., что вряд ли может служить доказательством функциональности данного оперона. Предположительно, groEL3 был получен данным штаммом случайно в результате горизонтального переноса mmo-генов от неизвестного метанотрофа. Таким образом, мы впервые изучили активность промоторных регионов оперонов groESL в штаммах M. oryzae и M. brachiatum и подтвердили их функциональность. В дальнейшем для более детального изучения функций и регуляции экспрессии шаперонинов GroEL планируется получить нокаутмутанты по отдельным паралогам генов groЕL методом сайт-специфической рекомбинации. |
