Clasificación funcional y clínica de variantes de ADN del gen BRCA2 mediante minigenes híbridos

Autor: Fraile-Bethencourt, Eugenia, Velásquez-Zapata, Valeria, Hernández, Marita, Díez-Gómez, Beatriz, Sanz, David J., Acedo, Alberto, Infante, Mar, Velasco, Eladio
Přispěvatelé: Ministerio de Economía y Competitividad (España), Instituto de Salud Carlos III, Universidad de Valladolid, European Commission
Rok vydání: 2015
Předmět:
Zdroj: Digital.CSIC. Repositorio Institucional del CSIC
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Popis: Póster presentado al XL Congreso de la Sociedad Española de Genética, celebrado en Córdoba del 16 al 18 de septiembre de 2015.
El exón17 de BRCA2 presenta un sitio donador de splicing atípico (GC), que aparecen en un 1% de los intrones humanos (Kralovicova et al., 2011). Su reconocimiento debe estar mediado por reguladores en el exón e intrón 17 y/o el exón 18. De esta forma, las mutaciones que afecten a estas secuencias podrían alterar el proceso de splicing de BRCA2 y estar así asociadas a cáncer de mama y ovario hereditario (CMOH). En este estudio, construimos un minigen en plásmido reportero de splicing pSAD® con los exones de 14 a 20 de BRCA2 para el estudio del splicing de los exones 17 y 18 en su contexto genómico, así como para evaluar el impacto funcional de mutaciones sobre este proceso. Se analizaron in silico el exón e intrón 17 y el exón 18 de BRCA2, para mapear los putativos sitios crípticos y los motivos ESE y ESS. Se analizaron 66 mutaciones del exón 17 y 145 del exón 18 con NNSplice y HSF, recogidas en BIC y UMD. Se seleccionaron 31 mutaciones candidatas de splicing en el exón 18 y 14 en el exón 17. Se construyó un minigen híbrido 14-20 de BRCA2. Las variantes seleccionadas fueron generadas en el minigen mediante mutagénesis dirigida y ensayadas funcionalmente en células HeLa. El MGBR14-20 produjo un transcrito estable de tamaño (2046nt) y estructura (V1-BRCA2 exones 14 a 20-V2) esperados. Las predicciones bioinformáticas coinciden con los resultados del estudio de elementos reguladores de splicing mediante microdeleciones solapantes. Hasta la fecha, se han ensayado 24 mutaciones (10 del exón 17 y 14 del exón 18), de las cuales 15 (62.5%) alteran el splicing. Once (46%) inducen anomalías mayoritariamente con transcritos aberrantes con codones stop prematuros o deleciones in-frame de regiones esenciales de la proteína BRCA2, de modo que podían ser clasificadas como patogénicas. Las alteraciones más frecuentemente encontradas son: exón skipping, uso de sitios crípticos de splicing y uso de aceptores o donadores de novo. Cabe destacar que 7 de las 12 mutaciones missense estudiadas (58%) provocaron este tipo de alteraciones. El minigen MGBR2 14-20 es una herramienta robusta para el estudio de mutaciones en los exones 17 y 18 debido a su estabilidad y al mantenimiento del contexto genómico con un total de 7 exones. El estudio de mutaciones que puedan afectar al proceso de splicing resulta de vital importancia, pues variantes de significado clínico incierto provocan graves alteraciones en el transcrito de BRCA2, y podrían ser reclasificadas como patogénicas.
EAV lab is supported by grant Fis: PI13/01749 from the Spanish Ministry of Economy and Competitivity, Plan Nacional de I+D+I 2013-2016, ISCIII, co-funded by FEDER from Regional Development European Funds (European Union), and grant CSI090U14 (ORDEN EDU/122/2014) from the Consejería de Educación (Junta de Castilla y León, Spain). EFB is supported by a predoctoral fellowship from the University of Valladolid (2015-2019).
Databáze: OpenAIRE
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